199563. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nebramicin és neomicin típusú antibiotikumok előállítására
1 HU 199563 A 2 zott legmagasabb pH érték nebramicin-típusú antibiotikumok esetében pH 9,0 (174.815 sz. magyar szabadalmi leírás), illetve neomicin esetében pH 8,5 érték (181.748 sz. magyar szabadalmi leírás), a hatóanyagok kinyerése és főleg tisztítása szempontjából nem jelent különbséget az általában alkalmazott alacsonyabb, pH 6-8 érték alkalmazásához képest. Megfelel annak az általános gyakorlatnak, amely szerint a gyengén savas kationcserélő gyanták pH 6-10 értéktartományban működtethetők illetve, hogy a megkötendő anyag bázicitásának figyelembevételével annak pK értékétől egy-két egységgel alacsonyabb pH értéket alkalmaznak a minél hatékonyabb megkötés érdekében. A fent említett pH 9,0 és pH 8,5 értéken történő ioncsere során a hatóanyagok tisztulásának mértéke nem számottevő, a megfelelő minőség elérését az ioncserét követő egyéb tisztítási műveletek (aktív szenes derítés, erősen bázisos anioncserélő gyanta alkalmazása, hidrogén-peroxidos roncsolás) segítségével valósítják meg. Az is ismeretes, hogy az utóbbi évek gyakorlata szerint, a fermentlé hatóanyagtartalmának növelésére irányuló törekvésekkel párhuzamosan a nebramicin- és neomicin-típusú antibiotikumok gyártása során alkalmazott pH-t inkább a savas pH tartomány felé (pH 4,5) tolják el. Az a tény, hogy az ioncsere lúgos, pH 9,5-12,0 tartományban is megvalósítható, meglepő, mivel a gyenge bázisok megkötődése a gyantán protonált formában történik és a protonálódás mértéke a pH növelésével fokozatosan csökken, így elméleti meggondolások alapján az általunk alkalmazott pH tartományban a hatóanyagok meg sem kötődhetnének a gyantán. Azáltal, hogy találmányunk szerint az ioncsere során lúgos pH tartományt alkalmazunk, az eddig gyakorlattól eltérően olyan körülményeket tudunk teremteni, amelyek között az egymáshoz igen közel álló bázicitású hatóanyag és az azt szennyező színanygok és minor komponensek közül csak a hatóanyag kötődik meg a gyantán, a számunkra értéktelen komponensek leszorulnak arról. A hatóanyagot tartalmazó lényegesen tisztább eluátum további feldolgozása során, az egyes antibiotikum komponensek egymástól való elválasztása szelektíven megvalósítható, illetve a kristályosításra vagy kicsapásra kerülő oldat lényegesen kevesebb aktív szénnel deríthető az egyéb, a színanyagok eltávolítására alkalmazott kezelési módszerek (pl. brómozás, hidrogén-peroxidos kezelés) feleslegessé válnak és a termék lényegesen jobb hatásfokkal kristályosítható. A lúgos pH tartományon belül, a 9,5-12,0, előnyösen 10,2-11,0 értékek közötti intervallumot találtunk a tisztítás hatásossága szempotjából optimálisnak. A lúgos pH tartományban végzett ioncserét összehasonlítva a hagyományos, semleges pH 7,5 körüli értéken végzett ioncserével, a tisztulás mértékében tapasztalható különbség a gradiens eluciós kromatográfla után kapott eluátumok extinkció értékei közötti különbséggel szemléltethető: E4%i cm (295 nm) pH: 7,5 1,4-1,6 pH: 10,2-10,8 0,4-0,4 A találmány szerinti eljárás megvalósítható bármely savas kationcserélő gyantával pl. Lewatit CNP-80, Amberlite IRC-50, Varion KCO, Wofatit CP-300 stb, illetve a lúgos pH tartományban végzett adszorpciós művelethez is számos adszorpciós gyanta felhasználható pl. Diaion HP-20, Diaion HP-21, Diaion SP-207, XAD-1184 stb. A lúgos pH tartományban végzett ioncserés vagy adszorpciós műveletet a szűrt fermentlé feldolgozásakor az egyes, ismert technológiai lépésekkel kombinálva több változatban is alkalmazhatjuk. Amennyiben a gyártás célja tobramicin, vagy kanamicin előállítása, a találmány szerinti megoldás előnyös megvalósítási módja szerint a lúgos pH tartományban végzett ioncserét oly módon iktatjuk be a fermentlé feldolgozásának menetébe, hogy a szűrt, neutrális (pH 7,5) fermentlé gyengén savas kationcserélő gyantán történő ioncseréje, majd a hatóanyagot ammónium-hidroxiddal történő leoldása után kapott karbamoil-tobramicint és karbamoil- kanamicint tartalmazó oldatot erős lúgos közegben, nátrium- hidroxiddal hidrolizáljuk, majd ezt követően állítjuk be, célszerűen kénsavval az oldat pH-ját 10,2-10,8 értékre és visszük a gyengén savas kationcserélő gyantára. A hatóanyagok ammónium- hidroxid vizes oldatával történő eluálása után kapott oldatot vákuumban kb. 30 % szárazanyag tartalomig töményítjük, pH-ját kénsavval 7,5 értékre állítjuk, majd ismert módon lépcsőzetes eluciós kromatográfiával elválasztjuk a tobramicint és a kanamicint. A tiszta tobraimicin- és tiszta kanamicin-bázis tartalmú oldatokat vákuumban bepároljuk, kevés aktív szénnel derítjük, a tobramicin-bázist kristályosítjuk illetve a kanamicin-szulfátot metil-alkoholból kicsapjuk. Abban az esetben, ha a lúgos pH tartományban végzett ioncserét a fent ismertetett módon hajtjuk végre, az ioncserélő gyantán nemcsak az antibiotikum bázisok kötődnek meg, hanem az oldatban lévő nátrium-ionok is. Tehát e művelet során egyúttal egy sómentesítés (nátrium-szulfát mentesítés) is megtörténik. Ennek gyakorlati jelentősége azért figyelemre méltó, mivel a lépcsőzetes gradiens eluciós kromatográfia előtt - az erősen lúgos hidrolizátum kénsavval történő semlegesítésekor keletkező - nagy mennyiségű nátrium-szulfátot el kell távolítani. A nátrium- szulfát mentesítést ezideig úgy oldották meg, hogy a nátriumszulfát tartalmú hidrolizátumot az oldattérfogatra számított hatszoros mennyiségű metil-alkoholba csorgatták és a kivált nátrium-szulfátot kiszűrték. A hatóanyagot tartalmazó vizes- metanolos oldatot vákuumban oldószermentesítették. E műveletek munka-, idő-, eszköz- és energiaigénye mellett egyéb környezetvédelmi és biztonságtechnikai problémákat is felvetnek, például a metil-alkohol légterébe kerülésének kivédése, a metil- alkohollal szennyezett nátrium-szulfát megsemmisítése és a metil- alkohol regenerálása. A lúgos pH tarományban végzett ioncserés tisztítás alkalmazható akkor is, ha a fenti eljárástól eltérd ioncserés, vagy kromatográfiás eljárással nyerték az aminoglikozid-típusú antibiotikum vizes sűrítményét (pl. tobramicin, kanamicin, apramicin, neomicin stb. vizes oldatát) A találmány szerinti megoldás alkalmazható akkor is, ha az antibiotikum kinyerése a fementléből nem ioncserélő gyantán való megkötéssel történik, hanem egyéb módszerrel, pl. extrakcióval, vagy komplex sóképzéssel. Ebben az esetben a feldolgozás során 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
