199561. lajstromszámú szabadalom • Eljárás S-657 jelű heteropoliszaharid előállítására és a heteropoliszaharidot tartalmazó kútfúró folyadék
HU 199561 B Kis méretekben a fermentációt előnyösen úgy végezzük, hogy egy alkalmas tápközeget beoltunk a tenyészettel, majd tenyésztő közegre történő átvitel után a fermentációt 30oC körüli állandó hőmérsékleten, rázógépen hagyjuk lefolyni néhány napig. A fermentációt sterilezett tápközegen kezdjük, egy vagy több oltóanyagtermelési lépésen keresztül. Az oltóanyagtermelési lépésben a tápközeg szén- és nitrogénforrások bármilyen alkalmas kombinációja lehet, előnyös szénforrás azonban a glükóz vagy a hidrolizált keményítő. Az oltóanyagtermelő lombikot állandó hőmérsékletű kamrában, mintegy 30°C-on 1—2 napig rázatjuk, vagy addig, amíg a növekedés megfelelő, és a kapott tenyészet egy részével vagy egy második oltóanyagtermelő lombikot, vagy a termelő közeget oltjuk be. Ha közbülső oltóanyagtermelő lépéseket, alkalmazunk; lényegében véve az előbbi módon tenyésztjük azokat, azaz az utolsó oltóanyagtermelési lépés lombikja tartalmának egy részét használjuk a termelő közeg beoltására. A beoltott lombikokat állandó hőmérsékleten néhány napig rázatjuk, és az inkubálás végén a lombikok tartalmát alkalmas alkohollal, például izopropanolia! kicsapjuk. Nagy méretekben végzett tenyésztéshez előnyös, ha a fermentációt alkalmas fermentorokban végezzük, amelyek keverővei és levegőztetővei vannak felszerelve. Megfelelő módszer az, ha a tenyésztöközeget a fermentorban állítjuk össze, és 121°C-ra történő felmelegítéssel sterilezzük. Hűtés után a steril közeget beoltjuk az előzőleg tenyésztett oltóanyaggal, és a fermentációt például 2— 4 napig folytatjuk, mialatt a tenyésztő közeget keverjük és/vagy levegőztetjük, és a hőmérsékletét kb. 30°C-on tartjuk. Az S-657 heteropoliszacharid ilyen módon történő előállítása különösen alkalmas nagy mennyiségben történő termelésre. S-657 jelű heteropoliszacharid Az ATCC 53159 sz. mikroorganizmus által termelt heteropoliszacharid szénhidrát mellett, mintegy 12 tömeg% proteinből és mintegy 7 tőmeg% acilcsoportból (O-acetil-csoportként számítva) áll, és lényegében véve nem tartalmaz piroszőlősavat és mannózt. Az S-657 jelű heteropoliszacharid szénhidrátrésze mintegy 19 tömeg% glükoronsavat (a termék egészére számítva) és mintegy 2:1 mólarányban ramnóz és glükóz semleges cukrokat tartalmaz. A' mintegy 7 tömeg% acetiltartalmat két különböző technikával határoztuk meg. Az S-657 jelű termék 0,2 tömeg%-os vizes oldatát bázisos hidroxil-amin-reagenssel, majd savas vas-klorid reagenssel kezeltük, és az eredményt kolorimetriásan mértünk (S. Hestrin, J. Biol. Chem. 180, 249—261 /1949/). Az O-acil-csoportot O-acetil-csoportként azonosítottuk, és folyadékkromatográfiásán határoztuk meg. 3 Az S-657 heteropoliszacharidban levő semleges cukrokat különböző módszerekkel határoztuk meg. Az első módszer szerint 50 mg S-657 heteropoliszacharidot 4 óra hosszat 5 100°C-on 1 mól/l-es kénsavval hidrolizáltunk. Lehűtés után 0,5 ml 3 mg/ml xilózt adtunk hozzá- belső standardként. A mintákat 3 ml telített bárium-hidroxiddal semlegesítettük, majd 2 csepp kongó-vörös hozzáadása után 10 addig adagoltuk a bárium-hidroxidot, míg a szín vörösre váltott. Centrifugálás után (20 perc, 3000 ford/perc) a minták felülúszóját bepároltuk. A száraz mintákat 0,1 ml 40 mg/ml-es, száraz piridinnel készült hidr- 15 oxibamín-hidroklorid-oldatban oldottuk, és 45 percig 90°C-on melegítettük.. Lehűtés után 0. 1 ml ecetsavanhidridet adtunk hozzá, és újra 45 percig 90°C-on melegítettük. A cukrokat aldonitril-acetát-származékaik gáz-fo-20 lyadék-kromatográfiával választottuk el, és autentikus mintákkal történő összehasonlítással azonosítottuk, és határoztuk meg menynyiségüket (J.K. Baird, M.J. Holroyde és D.C. Ell wood, Carbohydr. Rés. 27,464—467/1973/ 25 A semleges cukrokat egy másik módszerrel is meghatároztuk. 2 mg S-657 heteropoliszacharidot feloldottunk 2 ml 0,5 mól/i-es trifluor-ecetsavban. A mintákat éjszakán át 100°C-on tartottuk, szárazrapároltuk, majd 2Q 2 ml Vízben oldottuk. 25 mg nátrium-bór-hidridet adtunk hozzá, majd 2 óra múlva az oldatot Dowex 50 (H+)-val kezeltük, így a pH 3,5-re csökkent. Szűrés után az oldatot koncentráltuk, és háromszor 5 ml metanol- 35 lat kodesztil 1 áltuk. A maradékot feloldottuk 1 ml ecetsavanhidrid és 1 ml piridin elegyében, 1 óra hosszat 100°C-on tartottuk, és betöményítettük. Háromszor 5 ml toluollal történt kodesztillálás után a maradékot me- 40 tilén-kloridban oldottuk, és gáz-folyadék-kromatográfiával analizáltuk. 1. táblázat Teljes semleges cukortartalom az S-657 he- 4g teropoliszacharidban Mólszázalék Mólszázalék Ramnóz Glükóz 1. módszer (három ---------minta) 57 43 50 2. módszer 64 36 A poliszacharid glükoronsavtartalmát úgy határoztuk meg, hogy dekarboxilezést végeztünk 17 tömeg%-os sósavval, és a felszaba- 55 dúló szén-dioxidot nátrium-hidroxid-standardban felfogtuk, és visszatitráltuk (B.L. Browning, Methods of Wood Chemistry 2, 632— 633, /1967/). Három különböző S-657 minta dekarboxilezése 17,6 és 19,6 tömeg% közötti értéket adott. 60 A fenti savas hidrolízis semlegesített termékében jelen levő uronsavak azonosítására és elválasztására papír-elektroforézist végeztünk. Ezekből vett alikvot minták és ismert uronsav-standardok oldatát vittük fel 65 az elektroforézis papírra és az elektrofo-4 3
