199560. lajstromszámú szabadalom • Eljárás alfa-hidroxikarbonsavaknak a megfelelő l-alfa-aminokarbonsavakká történő folytonosüzemű, enzimatikus átalakítására
11UIW kJKJ\J L> Ebből a célból például a koenzimet előbb etiléniminnel oxidált alakjává, N(l)-aminoetilszármazékává alakítjuk át, amelyet azután a karbodiimiddel [lásd: Cuatrecanas, J. Bioi. Chem., 245. Köt., 3059. old. (1970)] egy olyan karboxilezett polietilénglikollá kapcsolunk, melynek polietilén lánca 500— 50.000, előnyösen 1.500—20.000 átlagmolekulatömegű. Az így nyert terméket azután a megfelelő NADH-származékká redukáljuk, Dimroth-féle átrendezéssel az N (6)-származékká alakítjuk át és adott esetben ismét a megfelelő NAD+ — származékká oxidáljuk. A növelt molekulatömegű koenzimet olyan mennyiségben használjuk fel, hogy az NAD+/NADH-koncentráció 0,1 —10 mmól/1, előnyösen 1 — 7 mmól/1 legyen. A membránreaktorba folyamatosan tápláljuk be az átalakítandó a-hidroxikarbonsav vizes oldatát a maximálisan oldódó mennyiség 25—100 t%-ának megfelelő koncentrációban. Természetesen lehetőség van arra, hogy az a-hidrokarbonsav valamely tiszta enantiomerjét, tehát vagy L vagy D formáját tápláljuk be és a membránreaktorba előzetesen a betáplált enantiomernek megfelelő, specifikus dehidrogenázt vigyük be. Sokkal előnyösebb azonban, ha az a-hidroxikarbonsavat racémátként használjuk. Ebben az esetben az alkalmazandó dehidrogenáz tekintetében három lehetőség van. Használhatunk olyan dehidrogenázt, amely csak az egyik enantiomerre specifikus. Ebben az esetben a másik enantiomer változatlan marad és a membránreaktort a szűrletárammal együtt hagyja el, amiből visszanyerhető. Alkalmazhatunk L és D enantiomerre specifikus dehidrogenáz-elegyet is. Ebben az esetben végül is mindkét enantiomert a kívánt a-aminokarbonsavvá alakítjuk át. Ugyanezt érjük el azonban akkor is, ha csak az L- vagy csak a D- enantiomerre specifikus dehidrogenázt alakalmazunk, a membránreaktorban azonban ezen túlmenően még egy, a használt a-hidrokarbonsavra specifikus racemáz is jelen van. A membránreaktorba ezen kívül folyamatosan tápláljuk be az átalakítandó a-hidroxikarbonsavnak megfelelő a-ketokarbonsavat is olyan mennyiségben, hogy annak koncentrációja a reaktorban a felhasznált aminokarbonsav-dehidrogenázra, számítva 1 —10 Km között legyen. Km jelentése itt az a-ketokarbonsavnak a felhasznált, és képzendő L-a-aminokarbonsavra specifikus dehidrogenázra vonatkoztatott adszorpciós egyensúlyi állandóinak reciprok értéke. Az a-ketokarbonsavat vagy az átalakítandó a-hidroxikarbonsav vizes oldatához adjuk hozzá vagy vizes oldat alakjában külön adagoljuk be. Ez utóbbi módszer adott esetben előnyösebb lehet, mert az adagolás ebben az esetben függetlenül szabályozható. A membránreaktorba továbbá folyamatosan ammóniumionokat táplálunk, az átalakítandó, a-hidroxikarbonsavvai minimálisan 3 ekvimoláris mennyiségben. De a reakciót az sem zavarja, ha 3-szoros ammónium-ion-mólfelesleget használunk. Az ammóniumionok betáplálása célszerűen úgy történik, hogy az átalakítandó a-hidroxikarbonsav vizes oldatához kívánt mennyiségben valamely alkalmas ammóniumsót, például ammóniumformiátot adunk. Az átalakítandó a-hidroxikarbonsávra specifikus dehidrogenázt célszerűen olyan mennyiségben alkalmazzuk, hogy az egyensúlyi állapotban a közbenső termékként fellépő, megfelelő a-ketokarbonsavra vonatkoztatott egyensúlyi átalakulásnak legalább 50%-at érjük el. A szükséges enzimkoncentráció a tartózkodási időtől és az a-hidroxikarbonsav kiindulási koncentrációjától függ. Egy órás tartózkodási időnél és 100 mmól/1 szubsztrátum-koncentrációnál általában elegendő egy 10 E/ml a-hidroxikarbonsav-dehidrogenáz aktivitás. Az. esetleg használt, az átalakítandó a-hidroxikarbonsavra specifikus racemázt célszerűen olyan mennyiségben alkalmazzuk, hogy a racemizálási reakció kielégítő sebességgel menjen végbe és ne váljék a teljes reakció sebesség meghatározó tényezőjévé. Ehhez általában elegendő egy 10 E/ml-es racemáz-aktivitás abban az esetben, ha ismét egy órás tartózkodási időből és 100 mmól/1 szubsztrátum-koncentrációból indulunk ki. Végül a képzendő L-a-aminokarbonsavra specifikus dehidrogenázt célszerűen olyan mennyiségben alkalmazzuk, hogy egyensúlyi állapotban az NAD+:NADH arány legalább 5:1 legyen. Ehhez 100 E/ml-ig terjedő aminokarbonsav-dehidrogenáz mennyiséget használunk, hogy egy órás tartózkodási idő és 100 mmól/1 szubsztrátum-koncentráció mellett legalább 90%-os egyensúlyi átalakulást állítsunk be, ami a kapcsolt reakciórendszerrel termodinamikailag lehetséges. A reakció alatt a membránon át 0,1 — 15 bar, előnyösen 0,2—3 bar nyomáskülönbséget kell fenntartani, amit egy megfelelően méretezett szubsztrátum oldat betápláló adagoló szivattyú, és adott esetben egy, a szűrletáramba a membrán mögött beiktatott tartószelep felhasználásával érünk el. A nyomáskülönbség hatására a szűrletáram a kívánt sebességgel lép át a membránon. A membrán nyomóoldalán az abszolút nyomást célszerűen úgy kell megválasztani, hogy a membrán előtt erőteljes turburencia létrehozására a reakciótérben végzett erős keverés vagy cirkuláltatás következtében a membrán mentén egy helyen se csökkenjen le annyira a nyomás, hogy a reakcióelegy kigázosodása következzék be a nyomóoldalon. Az erőteljes keverésre vagy cirkuláltatásra azért van szükség, hogy elkerüljük a membrán terhelését az enzimekkel vagy a megnövelt molekulasúlyú koenzimmel. A membránreaktort az enzimatikus reakcióknál szokásos 25—50°C hőmérsékleten 4 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
