199558. lajstromszámú szabadalom • Eljárás glükóz izomeráz enzim tisztítására
HU 199558 B Az adatokból látható, hogy 1000 ppm vagy ennél nagyobb BTC koncentrációnál semekkora oldható izomeráz aktivitás nem marad. 500 ppm BTC koncentrációnál a visszamaradó aktivitás 50%. Az 5. kísérletből származó csapadékot 5 ml 0,5 N nátrium-kloridban, szobahőmérsékleten újra szuszpendáljuk és keverjük. A csapadék pár perc alatt újra feloldódik. A kapott oldat 0,5 ml-es részét 19,5 ml 0,5 N nátrium-kloriddal hígítjuk és megvizsgáljuk az izomeráz aktivitás szempontjából. 2. példa A példa egy tisztított és koncentrált glükóz izomeráz oldat előállítására vonatkozik. Az 1. példa szerint előállított izomeráz extraktumból, amelynek összes aktivitása 12000 IGIU, fajlagos aktivitása pedig 2,7 mg IGIU/mg protein, kiveszünk egy 300 ml-es mintát és pH-ját pH=7,2 értékre állítjuk be nátrium-hidroxiddal. Annyi BTC-835-öt adunk hozzá, hogy a végső koncentráció 1000 ppm legyen, és az elegyet 15 percig keverjük. A keletkezett csapadékot szűréssel elkülönítjük, előszűrő réteg alkalmazásával. A szűrőpogácsát a szűrőben vízzel mossuk, a szűrlet és a mosófolyadék mintákat megvizsgáljuk izomeráz aktivitás szempontjából. Oldható aktivitás nem érzékelhető. A filterpogácsát 0,5 N nátrium-kloriddal eluáljuk. A nátrium-kloridos eluátumot egy Amicon401 (Amicon Corp., Danvers, MA) berendezéssel ultraszűrjük, egy XM100 membrán (100 000MWCO) alkalmazásával. Az ultraszűrési maradékot háromszor 5-térfogatrész 0,5 N nátrium-kloriddal diafiltráljuk a meg nem kötött BTC eltávolítása céljából. Végül a maradékot vízzel való diafiltrálással sómentesítjük. A végső maradék összes aktivitása 8860 IGIU, fajlagos aktivitása pedig 43.32 IGIU/mg protein. A kiindulási izomeráz aktivitás 73,8%-át visszanyertük és a 43.32 IGIU/mg protein fajlagos aktivitás érték azt jelzi, hogy a készítmény legalább 90%ban izomeráz, proteinre számítva. Mindezek alapján látható, hogy körülbelül 20-szoros tisztítást értünk el jó aktivitás hasznosítással. 3. példa A 2. példában leírt módon járunk el, az izomeráz extraktumot az 1. példában említett Streptomyces törzzsel történő utófermentálással állítjuk elő. Az izomeráz extraktumból (összes aktivitás 14 000 IGIU) kiveszünk 500 ml-t, és pH- ját pH=7,2 értékre állítjuk be. Ezután cseppenként annyi BTC-835-öt adunk hozzá, hogy a végső koncentráció 1000 ppm legyen. A kapott szuszpenziót 2 g szűrési segédanyaggal való összekeverés után szűrjük, és a szűrő9 pogácsát körülbelül 100 ml vízzel mossuk. A szűrletet és a mosóvizeket egyesítjük: ezeknek nincs izomeráz aktivitása. Ezután az átmosott szürőpogácsát in situ lassan ‘eluál-. juk 300 ml 0,5 N nátrium-kloriddal, három óra hosszat. A sós eluátumot egy Amicon XM-50 (50 000 MWCO) membrán alkalmazásával ultraszurjuk. Az ultraszürési maradékot 0,5 N nátrium-kloriddal, majd vízzel. deafiltráljuk a maradék BTC és só eltávolítása végett. A- végső maradék összes aktivitása 13 550 IGIU, fajlagos aktivitása pedig43,4 IGIU/mg. Ezekből látható, hogy a tisztítás olyan hatékony volt, mint a 2. példában és az aktivitás (94%) megőrzése jelentősen javult. 4. példa A példa olyan izomeráz extraktum tisztítására vonatkozik, amelyet Bacillus mikroorganizmusokkal nyertünk. A. A kiindulási enzimforrás száraz por volt, amely szűrési segédanyag hordozóval kevert Bacillus sejtekből állt. Azonosítási jele: Novo SP-103 izomeráz (Novo Industri A/S, Bagsvaerd, Dánia). Az enzim szolubilizálását úgy hajtjuk végre, hogy a port pH=7,0 értékű hígított Tris pufferben szuszpendáljuk, és lysozim (200 mg/100 g száraz enzim) hozzáadása után szobahőmérsékleten két óra hosszat keverjük. Ezután az előző példákban leírt szűrési eljárással eltávolítjuk az oldhatatlan anyagokat és a szűrletet 60°C hőmérsékletre melegítjük. 20 percig ezen a hőmérsékleten tartjuk, ezalatt a szennyeződések kicsapódnak és az extraktum pasztörizálódik. Előszűréses szűréssel eltávolítjuk az oldhatatlan anyagokat, majd az extraktum 10 ml-ét (262 IGIU) pH=7,2 értékre állítjuk be, és annyi BTC-835-öt adunk hozzá, hogy a végső koncentráció 1500 ppm legyen. A csaknem rögtön kiváló súlyos fehér csapadékot centrifugálással eltávolítjuk és az elfolyó folyadék egy alikvot mennyiségét megvizsgáljuk az enzim aktivitás szempontjából. Gyakorlatilag a kiindulási aktivitás (250 IGIU) teljesen jelen van az oldható frakcióban. B. Az A. részben leírtak szerint elkészített eredeti extraktum egy részét 1500 ppm BTC-835-tel kezeljük, és a kapott oldhatatlan anyagot szűréssel elkülönítjük és félre tesszük. A kezelt extraktumból 25 ml-es mintákat (mindegyik aktivitása 555 IGIU) veszünk és különböző mennyiségű BTC-835 hozzáadásával határozzuk meg, hogy milyen koncentráció szükséges az izomeráz kacsapásához. A BTC hozzáadása után a csapadékokat centrifugálással eltávolítjuk és az oldható fázis alikvot mennyiségeit megvizsgáljuk izomeráz aktivitás szempontjából. Az eredmények a II. táblázatban láthatók. .10 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 6
