199511. lajstromszámú szabadalom • Eljárás sárgaszínű, stabil humán albumin oldat előállítására emberi vérplazmából
HU 199511 A 2 A találmány tárgya eljárás sárga színű stabil humán albumin oldat előállítására emberi vérplazmából. Az emberi vérplazmából előállított albumin oldat gyógyászati felhasználásának jelentősége ismeretes. A szakirodalomban fellelhető eljárások közül plazmafehérjék, többek között albumin nagy mennyiségű előállítására még ma is többnyire az úgynevezett hideg alkoholos eljárást alkalmazzák [E. J. Cohn, J.L. Túl lis, D.M.Surgener és M.D. D’Hont, Science 114, 479 (1951)]. Ennek az eljárásnak azonban számos hátránya van, többek között és elsősorban a fehérjék denaturálásának a veszélye, továbbá a hűtés nagy energiaigénye és az eljárás során felhasznált nagy mennyiségű alkohol folytán a magas előállítási költségek. Ezen hátrányok kiküszöbölésére Cohn és munkatársai fentebb idézett közleményükben a 12. módszerben az alkohol elhagyásával ioncserélő gyanták és nehéz fémek alkalmazásával írnak le eljárást a plazmafehérjék frakcionálására. Számos más próbálkozás is történt a hideg alkoholos eljárás helyettesítésére, például sók, polikovasavak, rivanol, polietilén - glikol felhasználásával, -ezek az eljárások azonban a termelésben nem kerültek alkalmazásra. A kromatográfiás anyagok felfedezése [Porath, J. és Flodin, P. Nature 183, 1657 (1959)] és gyártása ezeknek mind szélesebb körű alkalmazását tette lehetővé, így az utóbbi években több kromatográfiás vérplazmafrakcionáló módszert dolgoztak ki, melyek gélszűrők és ioncserélők kombinált alkalmazásával érik el a kívánt célt [Curling, J.M., Berglöf, J.H., Lindquist, L.O., Eriksen, S., Vex Sang. 33, 97—107 (1977)] ; A.D. Friesen, J.M. Bowman, W.C.H. Bees, Nemzetközi Haematológiai Társaság 19. és Nemzetközi Vértranszfúziós Társaság 17. Kongresszusa, Budapest, 1982. 08. 01—07., Kongresszusi Közlemény 117—126 oldal] Ezeknek a plazmafrakcionáló eljárásoknak közös hátránya az, hogy az előállított albumin oldatok zöld színűek az érvényben lévő gyógyszerkönyvi előírások sárga színével szemben (L. Martinacke, M.P. Hemen, M. Goudemand, fentebb idézett Kongresszusi Közlemény 43—50 oldal). Ez a zöld szín oxidációval (például hidrogénperoxiddal), redukálószerekkel, vagy ibolyántúli fénynyel történő besugárzással eltüntethető ugyan, azonban e módszerek közös hátránya az, hogy az albumint annak oxidációja révén károsítják, illetve a tartós hatás biztosításához intravénás készítményekben a megengedettnél nagyobb töménységű redukálószert kellene alkalmazni. További hátrányt jelent, hogy a kromatográfiás plazmafrakcionáló eljárások végtermékeként nyerhető 20% albumint tartalmazó oldatok a gyógyszerkönyvi előírásoknak megfelelő vírusmentesítést célzó 10 órán át tartó 60°C hőmérsékleten történő hőkezelés [S. Gellis és munkatársai, The Journal of Clinical Investigation XXVII. kötet, 239. oldal 1 (1948)] után zavarosodást, vagy gyakran csapadékkiválást mutatnak. A kromatográfiás plazmafrakcionáló eljárások a fentebb ismertetett hátrányok következtében a nagyüzemi termelésben nem valósulhattak meg. A találmány célja a kromatográfiás plazmafrakcionáló eljárások hátrányainak kiküszöbölése olyan egyszerű eljárással, amely lehetővé teszi a gyógyszerkönyvi előírásoknak megfelelő sárga színű, stabil humán albumin oldat előállítását. A találmány alapja az a felismerés, hogy a kromatográfiás plazmafrakcionáló eljárás során nyert albumin oldat zöld színét az albuminhoz kötött bilirubinból a hőkezelés hatására bekövetkező oxidáció révén képződő biliverdin okozza. Ha az alvadási faktoroktól ismert módon [például P.R.Foster, J.G. Watt és munkatársai módszerével: Vox Sang. 42, 180—189 (1982)] mentesített vérplazmát az ismert kromatográfiás plazmafrakcionáló eljárásokkal (például J.M. Curling fentebb ismertetett közleménye szerint) gélszürőn sótalanítjuk, majd a sótalanítást követően kaprilsavval, vagy kaprilsav alkálifém-sójával, előnyösen nátrium-kapriláttal kezeljük és ezt követően centrifugáljuk, akkor a bilirubin a csapadékban marad, a továbbiakban a felülúszót az ismert módon kromatográfiásan tovább frakcionálva, majd ultraszűréssel töményítve, végül hőkezeléssel sterilezve, sárga színű, stabil humán albumin oldatot kapunk. Ez a felismerés azért meglepő, mert a nyers plazmában albuminhoz kötött bilirubinnak az albumintól való elkülönítésére szolgáló eljárás a szakirodalomban nem ismeretes. Számos közlemény foglalkozik ugyan főleg apoláros jellegű szerves vegyületek adszorpciós megkötésével albuminhoz, ezen közleményekben ismertetett eljárások azonban az albumin kötőhelyeinek a megismerését célozzák a gyógyszermolekulák tervezésének szempontjaira tekintettel, így például 3—18 szénatom-számú zsírsavak kötődésének vizsgálatával ‘ [Mol. Pharmacol. 24, (3) 458—463 (1983); Chem. Abstr. 100: 29307 z, valamint Biochem. Pharmacol. 31, (24) 4019—4029 Chem.Abstr. 98: 27352 b] jelölik a kötőhelyeket; e közlemények egyike sem tartalmaz azonban kitanítást a nyers vérplazma bilirubin mentesítésére vonatkozóan. Az eljárásunkkal bilirubin-mentes halványsárga színű albumin oldat stabilnak mutatkozott, zavarodását, vagy csapadékkiválást több napos állás után sem észleltünk. Elektroforetikus vizsgálatokkal igazolni tudtuk, hogy az ismert kromatográfiás plazmafrakcionáló módszerrel előállított albumin oldat állás utáni zavarosságát, illetve á csapadékkiválást a,-globulin jelenléte okozta, melyet a mi eljárásunkkal előállított albumin oldatban kimutatni nem lehetett. Ez a felismerés azért meglepő, mert a,-globulinnak vérplazmából kaprilsavval, vagy 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
