199508. lajstromszámú szabadalom • Eljárás GRF peptidek és ezeket hatóanyagként tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
HU 199508 B A kapott anyagot TLC-vel és HPLC-vel vizsgálva az lényegében tisztának bizonyult. [a]?=-49,7°±l (c=l, 1%-os ecetsav) A fentiekben felsorolt analógokon kívül még az alábbi analógot állítottuk elő a fentiekben leírt szilárd fázisú szintézis útján: [Leu* 1 * 1, Nie27] -rGRF (l-29)-NH2 [ot]§2 * * 5 * * * *=—52,8°d=l (c=l, 1%-os ecetsav) A példák szerint előállított szintetikus peptideket összehasonlítottuk a szintetikus tisztított hGRF(l-40)-OH-val vagy a tisztított szintetikus hGRF(l-40)-Phe-Gly-NH2-vel in vitro vizsgálatokban, hogy meghatározzuk a növekedési hormon felszabadítására gyakorolt aktivitásukat. Az összes analóg nagy aktivitással rendelkezik a GH felszabadítására. Az in vitro vizsgálatokat úgy végeztük,, hogy a szintetikus hGRF-t használtuk standardként és a különböző szintetizált analógok ekvimoláris koncentrációit egymás mellett hasonlítottuk össze. Olyan tenyészeteket alkalmaztunk, amelyek négy vagy öt nappal a vizsgálat előtt patkányokból eltávolított hipofízis sejteket tartalmaztak. Azokat a tenyészeteket használtuk fel az összehasonlító vizsgálatok céljára, amelyekről úgy gondoltuk, hogy optimálisak a növekedési hormon kiválasztás szempontjából, mint az Vale és munkatársai (Endocrinology, 91, 562— 572 /1972/) ismertették. A vizsgálandó anyagot 3—4 órán keresztül inkubáltuk a tenyészettel együtt, majd a táptalajból egyenlő mennyiségeket vettünk, és megmértük az immunoreaktív GH (ir GH) tartalmukat jól definiált radioimmunvizsgálati módszer segítségével. Az összehasonlító vizsgálatok eredményeit, melynek során az anyagokat ekvimoláris koncentrációban alkalmaztuk, a következő I táblázat mutatja. I. táblázat Peptid A hGRF(l-40) -Phe-Gln--NH2-höz viszonyított relatív in vitro aktivitás 13 Nie27] -hGRF ( 1 -32)-NH2 3,21 (2,02—5,43) His1 ] -hGRF ( 1 -32) -NH2 2,15(1,12—4,41 ) I le27] -hGRF ( 1 -32) -OH 0,20 (0,11 —0,35) D-Tyr'] -hGRF ( 1 -32)-NH2 0,74 (0,47—1,14) D-Met27] -hGRF(1-32) -NH2 0,22(0,13—0,36) Phe1 ] -hG RF ( 1 -32) -NH2 0,13 (0,05—0,29) Phelfl] -hGRF(l-32)-NH2 0,69(0,26—2,63) Val27]-hGRF (1-32)-OH 0,31 (0,21—0,45) His\Nle27] -hGRF (1-32)-NH2______________ 3,22 (2,12—5,33) A szintetikus peptideket in vitro vizsgálva úgy találtuk, hogy az ECM értéke 20— 100 pikomól közötti, a legkisebb hatásos koncentráció 3—8 pikomólos. A h-GRF (1-40) -NH2 maximális hatásos koncentrációja 1 nanomól volt. Az ekvimoláris koncentrációjú különböző hGRF analógos rGRF-hez viszonyított összehasonlító vizsgálatát a II. táblázat mutatja-II. táblázat Peptid_________________összehasonlítás, % hGRF (1-40)-OH (a vizsgálat standardje) 100 rGRF (1-43)-OH 300 rGRF(l-29)-NH2 1100 [D-Tyrl0 * * * *l-rGRF ( 1 -29) -NH2 34 [D-Tyr1-1*]-rGRF (1-29)-NH2 600 [Tyr1] -rGRF ( 1 -29) -NH2 920 [Nie27] -rGRF (1-32) -NH2 1390 [Leu1, Nie27]-rGRF( 1-29)-NH2 480 [D-His1,D-Tyr10,D-Alá15] -rGRF(l-29)-NH2 29 rGRF- [Val44-NH2] 670 14 Ezeknek a szintetikus peptideknek az in vitro vizsgálata azt mutatta, hogy az EC50 értéke 20—100 pikomól koncentráció között változik, és a legalacsonyabb hatékony koncentráció 3—8 pikomól. A maximális hatékony koncentráció rGRF(l-43)-OH esetén 1 nanomól. A növekedési hormon kiválasztásával kapcsolatos in vitro vizsgálatokon kívül in vitvo vizsgálatokat is végeztünk úgy, hogy a szintetikus pepiidet egy az állatokba beoperált katéteren keresztül közönséges hím patkányokba fecskendeztük be. Az állatokat előzetesen FLA-63-mal, egy dopaminnal hidroxiláz inhibitorral kezeltük, mely anélkül szorítja vissza a spontán GH kiválasztódást, hogy az exogén GRF válaszra hatást gyakorolna. Az állatokból a katéteren keresztül közvetlenül a befecskendezés előtt, majd 5 és 20 perccel az injekció után vérmintákat vettünk. A vér GH szintjét radioimmunvizsgáiatokkal mértük meg. Az eredmények azt mutatták, hogy a szintetikus hpGRF analógok hatékonyan elősegítik a hipofízis GH kiválasztódását. Ügy találtuk, hogy 20 nanogramm — 25 mikrogramm/testsúly kg nagyságú dózisok hatékonyak. A további vizsgálatok azt mutatták, hogy az egyéb szintetikus hGRF analógoknak is nagy az aktivitásuk, és ezekből a vizsgálatokból az alábbi következtetéseket szűrhetjük le: 1. A 39 gyöknél több gyökből álló GRF peptidek aktivitását nem növeli a C-terminális amidálás, de a 39 gyöknél kevesebb gyökből álló peptidek aktivitását emeli. Például az [Ile27]-hGRF(l-32)-NH2 nagyobb aktivitású, mint a [Ile27]-hGRF (1-32)-OH; az [D-Tyr1,Nie27] -hGRF(l-32)-NH2 nagyobb aktivitású, mint a [D-Tyr1,Nie27] -hGRF(1-32) -OH; és a [Ile27]-hGRF(l-29)-NH2 nagyobb aktivitású, mint a 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
