199504. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nukleinsavszármazékok és ezeket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
HU 199504 B A táblázatból látható, hogy a (II) anyag toxicitása sokkal kisebb, mint áz (I) anyagé. Ebből látható, hogy a toxicitás szorosan megegyezik a nukleinsavszármazék lánchosszával. A találmány szerinti eljárást a következő példákkal szemléltetjük a korlátozás szándéka nélkül. PÉLDA (1) Kettős szálú nukleinsavszármazékok előállítása Ekvimoláris mennyiségű kereskedelmi poli-C-t (S érték 6^12) és poli-I-t (S érték 6—12) feloldunk 50 mmól/l-es, NaCl-t tartalmazó Tris-pufferben, 10—20 mg/ml koncentrációig. Az oldatot vízfürdőn szobahőmérsékletről fokozatosan 68°C-ra melegítjük, és ezen a hőmérsékleten tartjuk 10 percig, majd hirtelen lehűtjük szobahőmérsékletre. Ezután 4°C- on tároljuk. - — Az Így kapott oldatot fagyasztva szárítjuk, és így 1,2 g fehér szilárd anyag formájában nukleinsavszármazékot kapunk, amely a fent említett (I) anyag (S értéké TS1—24). Ugyanilyen módon, poli-C helyett poli(C|2,U)-t alkalmazva poli-I.poli(C12,U)-t állítunk elő ((III) anyag, S érték 13—24). Továbbá, ugyanilyen módon poli-C helyett poli(C20,S2 * 4U)-t használva poli-I.poli(C20,S4U)-t állítunk elő ((V) anyag, S érték 13—24). Ugyanilyen módon állítjuk elő a többi vizsgált anyagot is. (2) A nukleinsavszármazékok átalakítása kismolekuUjií anyagokká 1 g, a fenti módon, az (1) lépésben kapott (I) vizsgálati anyagot feloldunk 120 ml vízben, és hozzáadunk 30 ml 5 mól/l-es NaCl oldatot és 120 ml formaldehidet. A kapott elegyet élénken keverve homogén oldatot állítunk elő. A reakcióelegyet 8 óra hosszat 80°C-on hevítjük, majd vízzel szemben teljesen dializáljükTés fogyasztva szárítjuk, így 0,95 g fehér szilárd anyagot kapunk. A kapott anyag a (II) anyag (S érték 8). 1 g, az (1) lépésben kapott (III) anyagot feloldunk 120 ml vízben, és hozzáadunk 30 ml 5 mól/l-es NaCl oldatot és 120 ml formaldehidet. A kapott elegyet élénken keverve homogén oldatot állítunk elő. A reakcióelegyet 8 óra hosszat 80°C-on hevítjük, majd vízzel szemben teljesen dializáljuk, és fagyasztva szárítjuk, így 0,95 g fehér szilárd anyagot kapunk. A kapott anyag a (IV) anyag (S érték 9). 1 g, az (1) lépésben kapott (V) anyagot feloldunk 120 ml vízben, és hozzáadunk 30 ml 6 mól/l-es NaCl oldatot és 120 ml formaldehidet. A kapott elegyet élénken keverve homogén oldatot állítunk elő. A reakcióelegyet 12 11 óra hosszat 60°C-on hevítjük, majv vízzel szemben teljesen dializáljuk, és fagyasztva szárítjuk, így 0,95 g fehér szilárd anyagot kapunk. A kapott anyag a (VI) anyag (S érték 9). Az 1. ábra az egyes vizsgált anyagok HPLC (gélszűrési) eluciós mintáját mutatja. Az ordináta tengely a 260 nm-es abszorbanciát, míg az abszcissza tengely a réténciós időt és a megfelelő bp értéket mutatja. Az ábrán (1) megfelel (I) anyagnak, (2) megfelel (III) anyagnak, (3) megfelel (IV) anyagnak, (4) megfelel (II) anyagnak, (5) megfelel (V) anyagnak és (6) megfelel (VI) anyagnak. A HPLC-t a következő körülmények között végeztük: TSK-gél G-DNS-PW gélszűrő oszlop. Eluálószer: 1 mmól/l-es EDTA és 0,3 mól/l-es NaCl-t tartalmazó Tris-HCl-puffer (pH=7,5). Eluálási arány: 0,2ml/perc Az eluálás ideje függvényében kaptuk a fent említett mintát (abszcissza tengely). A detektálásra ultraibolya abszorpciós hullámhosszt, 260 nm-t alkalmaztunk, és az abszorbanciát a 0,04 OD/ml teljes skálájánál ábrázoltuk az ordináta tengelyen. Az abszcissza tengely alatti számértékek (bp) a DNS bázisainak számát jelölik. Markerként M13 fág RF-DNS restrikciós enzimmel hidrolizált fragmenseit használtuk. Az (I) anyag eluciós mintája ((1) görbe az ábrán), a (III) anyag eluciós mintája ((2) görbe az ábrán) és az (V) anyag eluciós mintája ( (5) görbe az ábrán) jól megegyezik egymással, az eluciós csúcs a minta felvitele után 34 perccel jelenik meg minden esetben. A csúcs az oszlop „kizárt térfogatát" jelöli, amelyből megfigyelhető, hogy ezekben az anyagokban az alkotóelemek majdnem mindegyike 6000 vagy ennél több bázist tartalmaz. Emellett megfigyelhető, hogy a kismolekulájú vizsgált anyagok, a (II) anyag ((4) görbe), a (IV) anyag ((3) görbe) és a (VI) anyag ((6) görbe) molekulaméret eloszlása a meghatározott határok közé esik, és a maximális molekulaméret eloszlás (csúcs) 150 (bázisszám) és 600 (bázisszám) közelében jelent meg a kismolekulájú anyagok esetén. Ha a molekulaméretet „bázisszám"-ban adjuk meg, a bázisszám egysége megegyezik „bp"-vel az 1. ábra. Példaképpen poli-I.poli-C-t vizsgáltunk, amelyet az alkotó kismolekulájú anyagokra hasítottunk, és a reakcióidőt és -hőmérsékletet különféleképpen változtattuk. Az eljárással kapott kismolekulájú anyagokat a molekulaméret eloszlás maximumával (bázisszám) és molekulaméret eloszlással (bázisszám) jelölve említjük. 12 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 7
