199470. lajstromszámú szabadalom • Eljárás castanospermin észterek és glikozidok valamint ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
HU 199470 B elegyet ezt követően további 30 percig inkubáltuk, majd 3 percig 80—100°C-on hőkezeléssel inaktiváltuk. A kicsapódott fehérjét centrifugálással eltávolítottuk és a felszabadított glükóz mennyiséget glükóz dehidrogenáz reagensek (Seragen Diagnostics) alkalmazásával meghatároztuk. A lizoszómás a-glükozidázt patkány májból izoláltuk, és részben tisztítottuk Dissous eljárásának alkalmazásával (Anal. Biochem. 116, 35 (1981)) ammóniumszulfát frakcionálási lépések segítségével. Az enzimet a vizsgált vegyülettel együtt 1 óráig 37°C-on in-5 kubáltuk, mielőtt 0,6 ml végtérfogatú 0,1 mólos nátriumacetátban készült p-nitro-fenil-a-D-glükozidot, 25 mmól nátriumkloridot (pH=4,2) adtunk hozzá. Az elegyet további 5 30 percig 37°C-on inkubáltuk, majd hőkezeléssel 90°C-on inaktiváltuk. A kicsapódott fehérjét centrifugálással eltávolítottuk. A felülúszóhoz 1,0 ml 0,1 mólos nátrium-karbonátot adtunk, és a felszabadult nitrofenol meny- 10 nyiségét 410 nm hullámhossznál jellemző elnyelése alapján meghatároztuk. A vizsgált, találmány szerinti vegyületek által adott eredményeket az I. táblázatban közöljük. 6 I. TÁBLÁZAT IC 50 Castanospermin származék 6-benzoát 6- (/*-f luor-benzoát ) 6- (/(.-metil-benzoát) 6- (4~motoxi-benzoát) 7- benzoát 7“ (A-~f luor-benzoát) 7~ (2,^-diklór-benzoát) 6,7~dibenzoát ő, 7-bisz(fr-f luor-benzoát) 6,8-dibutirát 8- a-D-gIukopiranozid Bélrendszerben! szukráz (mól) Lizoszómás-gltikozidáz (mól) 8 X 00 1 o 8 X 2 X 10~7 h X 1cf6 3 X 1 <f 7 1 X 1 cf 3 2 X 10~6 1 X 1 cf 3 2 X 1 o“6 2 X 10“^ U X 10“7 6 X 10~ 6 k X 10“7 1 X 10~ ** 2 X 10~6 > 1 (f 3 h X 10~6 > 1 cf 3 2 X 10“7 > 1 cT3 5 X 1 cf 8 3 X i(TZf A fenti eredményekből kitűnik, hogy a találmány szerinti eljárással előállított vegyületek alacsonyabb IC50 értékkel rendelkeznek a bélrendszerben! szukráz enzimmel szemben, mint a lizöszómás a-glükozidáz enzimmel szemben. A találmány szerinti vegyületeket továbbá megvizsgáltuk szacharóz terhelési tesztvizsgálattal, hogy meghatározzuk vérsavó glükóz-tartalom emelkedésében kifejtett inhibiáló hatásukat. A tesztvizsgálatot az alábbiak szerint végeztük. 18—20 óráig előzetesen éheztetett ICR Swiss egereknek orálisan a vizsgált vegyü- 4 letet és szacharózt adagoltuk 2,0 g/kg mennyiségben. A szukróz adagolása után 30 perccel 55 az állatokat megöltük, és vérsavójuk glükóz koncentrációját meghatároztuk. Á vegyület azon mennyiségét, amely ahhoz szükséges, hogy jelentősen inhibiálja a vérsavó glükóz koncentráció emelkedését, csak szukrózzal kegQ zeit állatok esetében mért értékekkel összehasonlított vizsgálati adatokból határoztuk meg. A hatás kifejtésének időtartamát úgy vizsgáltuk, hogy az egereknek kétszer orálisan adagoltunk szukrózt és hatóanyagot. Első dózis a vizsgált vegyület vagy hordozóanyaga volt. 65 Ezt követően 1, 2 vagy 3 óra múlva az egér-
