199446. lajstromszámú szabadalom • Eljárás metiléndioxi-fenantrén- és sztilbén-származékok és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
HU 199446 B 6 Az ürü-vörösvérsejtek opszonifikáíása Az 1 ml ürüvért kétszer 4 ml PBS/BSA oldattal mossuk (centrifugálás 10 perc, 500 xg) A mosott vért 1:50 arányban PBS/BSA oldattal hígítjuk. Az ürü-vörösvérsejtek elleni antiszérumot PBS/BSA oldattal 1:200 arányban hígítjuk. A hígított ürüvért és a hígított antiszérumot 1:1 arányban keverjük és 1,5 órán át kíméletesen rázva (körülbelül 80 ford/ /perc) inkubáljuk. A szövettenyésztő lemezek mindegyik tartályába, amely az ádherenes makrofágokat a fedőlemezkéken tartalmazza. 0,5 ml opszonifikált vörösvérsejt-szuszpenziót pipettázunk. A lemezeket 20 percig 37°C-on, 8% C02 jelenlétében inkubáljuk. Ezután a feleslegben lévő vörösvérsejteket leszivatjuk és a fedőlemezkéket 0,5% magzati borjúszérumot tartalmazó DMEM tápoldattal kétszer mossuk. A nem fagocitált vörösvérsejtek oldásához ezeket minden esetben 1 ml NH4Cl-trisz-pufferral kezeljük, (úgy találtuk, hogy 3,75 perc behatási idő megfelel). A puffer leszivatása után a fedőlemezkéket PBS/BSA oldattal kétszer mossuk. A fagocitózis kimutatása (festési technikák) A fagocitózis után a makrofágokat Pappenheim szerint kombinált May-Grünwaid-Giemsa eljárással megfestjük. A festést a szövettenyésztő tálak tartályaiban végezzük. 5 perc Konc. May-Grünwald-oldat, leszivatva 3 perc kétszer desztillált H20, minimum 85%os foszforsavval 7,0 pH-értékre beállítva, leszivatva, 9 perc Giemsa oldat 1:40 hígításban és használat előtt megszűrve, leszivatva, desztillált vízzel palackból leöblítve. A sejtmagok a festés után vörös-ibolya színűek, a citoplazma világoskék. A fagocitált vörösvérsejtek halvány rózsaszínűek. A mikroszkóp-preparátumokat levegőn szárítjuk, majd „Eukitt" ragasztóval tárgylemezekre ragasztjuk (három preparátum/egér). Mikroszkópos kiértékelés Egy egér három mikroszkóp-preparátumból kettőt számoltunk meg. Olajimmerziós, 1000-szeres nagyítású Zeiss mikroszkópot használtunk. A harmadik preparátumot csak akkor használtuk fel, ha két preparátumból az eredmény nem volt egyértelmű. Preparátumokként 300 sejtet számláltunk, és ezeket a fagocitózis aktivitástól függően vörösvérsejt/makrofán növekedő számával osztályokba soroltuk. 5 Osztály Vörösvérsejt/makrofág 1. O 2. 1 3. 2 4. 3 5. 4 6. 5 7. 6 8. 7 9. 8 10. 9 11. 10 12. 11—20+ +A számításokhoz feltételeztük, hogy >11 vörösvérsejt/makrofág esetében a 12. osz. tályban a megoszlás súlypontja 12 vörösvérsejt/makrofág. A 12. osztálybeli makrofágok viszonylag ritkán fordulnak elő. Adatfeldolgozás és grafikus ábrázolás A mikroszkóp-preparátumok számlálását speciálisan beprogramozott WANG LVP 2200 számítógépen végeztük, ami a számlált osztályok külön-külön való regisztrálását lehetővé tette. Az egyes adatok közepelését az „MA 1" programmal, a grafikus ábrázolásokat az „NPL"programmal végeztük. A stimuláló hatást minden egyes, kísérleti anyagra és dózisra kétféle módon mutattuk ki: 1) a makrofágok eloszlása az osztályokra (vörösvérsejt/makrofág) %-ban, a 300 sejtre mint 100%-ra. Ennek során azoknak a makrofágoknak a száma is a grafikus ábrázolásba kerül, amelyek vörösvérsejtet nem fagocitáltak; 2) a fagocitált vörösvérsejtek eloszlása (a makrofágok száma egy osztályban x a vörösvérsejt/makrofág szám) az osztályokra %-ban,a fagocitált vörösvérsejtek összes számára, mint 100%-ra. Ennek során azoknak a makrofágoknak a számát, amelyek vörösvérsejteket nem fagocitáltak, nem vesszük tekintetbe. Paraméter A makrofág-stimuláláshoz paraméternek a fagocitózis-aktivitás növekedését tekintettük, a fagocitált vörösvérsejtek pro makrofág (=osztály) számával kifejezve. A stimulálás megmutatkozik azon makrofágok számának a csökkenésében, amelyek vörösvérsejteket nem vagy csak kevés vörösvérsejtet fagocitáltak és azon makrofágok számának a növekedésében, amelyek több vörösvérsejtet fagocitáltak. A találmány szerinti vegyületek előállítását az alábbi példák szemléltetik. 1. példa l-Karboxi-3,4-metiléndioxi~2’-metoxÍ-sztilbén előállítása a) 6-Bróm-piperonil-bromid előállítása Vegyszerek: piperonil-alkohol (EGA-Chemie, illetve Aldrich) 120 g, bróm 48 ml, 120 ml ecetsavban, ecetsav 240 ml. Csepegtető tölcsérrel, szárítócsővel és belső, hőmérővel felszerelt 1 literes háromnyakú gömblombikba előkészítjük a piperonil-alkoholt az ecetsavban és jégfürdőben lehűtjük. Ehhez az oldathoz keverés közben lassan hozzácsepegtetjük az écetsavban oldott brómot, úgy, hogy a hőmérséklet 15—25°C között maradjon. A reakciókeveréket éjszakán át állni hagyjuk, a kivált kristályokat leszivatjuk, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
