198953. lajstromszámú szabadalom • Eljárás enkefalináz gátló hatású glikopeptidek, aminosav származékok és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 198953 B 2 amennyiben ezek legalább a felsorolt vegyttletek egyikét szintetizálják. Ilyen mutánsokat ismert módon fizikai eszközökkel, például besugárzással, így UV vagy röntgen-sugárzással vagy kémiai mutagénekkel, így például etán-szulfonsav-metil-észterrel (etil-metil-szulfonáttal, EMS) vagy 2-hidroxi-4-metoxi-benzofenonnal (MOB) állíthatjuk elő. Az aerob fermentációhoz előnyös szénforrásként megfelelőek az asszimilálható szénhidrátok és cukoralkoholok, így a glükóz, laktóz vagy D- mannit, valamint szénhidrát tartalmú természetes termékek, így maláta extraktum, olajok és zsírok. Nitrogén-tartalmú tápanyagként szóba jöhetnek az aminosavak, peptidek és proteinek, valamint ezek bomlástermékei, így peptonok vagy triptonok, továbbá húskivonatok, őrölt magvak, például kukoricamag, búza, bab, szója vagy gyapot őrlemények, alkoholgyártásból származó desztillációs maradékok, húsiiszt, éiesztőkivonat, ammóniumsók, nitrátok. A tápoldatban szervetlen sóként alkalmazhatunk például alkálifémvagy alkáliföldfém-kloridot, -karbonátot, -szulfátot vagy -foszfátot vagy nyomelemeket, így például vasat, cinket, kobaltot és mangánt. Az enkasztin-képzés különösen jól zajlik olyan tápoldatban, amely a teljes tápoldat tömegére vonatkoztatva 0,1 — 15% tápanyagot tartalmaz, így például szójalisztet, szójaolajat és mannitot, különösen 0,1 - 3% mennyiségben. A fermentálást aerob körülmények között végezzük, így például szubmerz körülmények között állandó rázás vagy keverés közben, rázóiombikban vagy fermentorban, adott esetben levegő vagy oxigén bevezetése közben. A fermentálás hőmérséklete 18 — 35 °C, előnyösen 25 — 30 °C, különösen 28 — 30 °C. A pH-tartomány 6 — 8, előnyösen 6,5-7,5. Ilyen körülmények között a fermentié általában 6 — 15 nap múlva jelentős enkefalináz-gátló hatást mutat. A tenyésztést előnyösen több lépcsőn keresztül folytatjuk, vagyis először egy vagy több tenyészetet állítunk elő folyékony tápközegben, majd ezeket a tulajdonképpeni termelő közegbe, a főtenyészetbe, például 1:10 térfogatarányban átoltjuk. Az előtenyészetet például úgy állíthatjuk elő, hogy tápoldatba micéliumot oltunk, és körülbelül 80 — 400 órán keresztül növekedni hagyjuk. Az átoltáshoz szükséges micéliumot úgy állítjuk elő, hogy a törzset körülbelül 12 napig szilárd vagy folyékony táptalajon, például élesztő-maláta-agar táptalajon növekedni hagyjuk. A fermentáció menetét ellenőrizhetjük a tenyészet pH-értéke vagy a micélium térfogat alapján, vagy a biológiai aktivitás meghatározásával. Mind a micélium, mind a szűrlet tartalmazza az enkasztint. Az enkasztin fő tömege azonban a szűrletben található. Az említett vegyületeket a tápközegből ismert módon a termék kémiai, fizikai és biológiai tulajdonságát tekintetbe véve izoláljuk, így például ioncserélőn, molekulaszitán, abszorpciós gyantán és fordított fázisú hordozóanyagon kromatografáljuk, oldószerrel kicsapjuk, reverzozmózi•osan vagy egyéb módszerrel izoláljuk. Előnyös, ha a micéliumot például szűréssel vagy centrifugálással elválasztjuk a vizes fázistól, és az enkasztint az egyes fázisokból izoláljuk és tisztítjuk. Előnyös, ha a szűrletet zsírtalanítás céljából butanollal extraháljuk, és a vizes fázist vákuumban bepároljuk. A kétszeres-ötszörös mennyiségű metanollal hígított vizes koncentrátumból centrifugálással elválasztjuk a kivált nagy molekulájú anyagokat. A vizes-metanolos felülúszót erősen savas ioncserélővel, így például Dowex 50 WX 2-vel először a bázikus, majd anioncserélővei, így például Amberlite IRA-68-cal az amfoter anyagokat izoláljuk. Ebben a frakcióban találhatók az enkasztinok. Sótalanítás után molekulaszitával, így például Sephadex G-15-tel, preparatív HPLC-vel, például fordított fázisú RP-18-cal az egyes enkasztin-komponenseket kinyerjük. Az N-(l-dezoxi-fruktóz-l-il)-L-aminosavak szintézisét már többször leírták (például H. Röper és munkatársai, Carbohydrate Research, 116 (1983) 183 — 195). Ebben az esetben a helyettesítetlen reagenseket oldják fel vízben vagy víz — metanolban, és különböző pufferokkal vagy adalékokkal, például nátrium-piroszulfittal melegítik. A kitermelés a kiindulási anyag fajtájától függően átlagosan 20%. Meglepő módon azt tapasztaltuk, hogy ha a cukrokat szabad aminocsoportot tartalmazó sminosavakkal vagy peptidekkel a kívánt Amadori-termékké alakítjuk, és az átalakítást szekunder vagy tercier, alifás vagy aromás nitrogéntartalmú vegyületek katalízisével, például piridin, dimetil-amino-piridin-, di-(l —8 szénatomos alkil)- és tri-(l — 8 szénatomos alkil)-amin, 6—12 szénatomos aril-(l —8 szénatomos alkil)amin, trisz-puffer, dimetil-formamid, imidazol katalízisével végezzük, akkor nagyon jó kitermelést érünk el, azaz 90% feletti kitermelést. Oldószerként felhasználhatunk piridint, vizet, vizes metanolt, metanolt, etanolt, dimetil-szulfoxidot (DMSO) vagy ezeknek egyéb keverékeit, előnyösen azonban vízmentes piridint alkalmazunk, vagy vízmentes metanollal, DMSO-val vagy egyéb oldószerrel alkotott elegyét. A reakció hőmérsékletét széles tartományban változtathatjuk. A lehetséges hőmérséklet 0-250 °C. Előnyösen azonban szobahőmérséklet — 120 °C közötti hőmérsékleten dolgozunk. A hőmérséklettől függően a reakció időtartama néhány másodperctől néhány napig tarthat. Egy tipikus reakciókeveréknél a reakció hőmérséklete 65 °C, és 2 óráig tart. A majdnem kvantitatív átalakítás arról ismerhető fel, hogy az eredetileg színtelen reakcióelegy aranysárgára színeződik. Ha a reakció tovább zajlik, akkor a reakcióelegy sötétebbé váló barna színű lesz, amely a kitermelés kárára megy (Mailland-reakció). Az Amadori-átrendeződés (Weygent/Hilgetag, "Organisch-chemische Experimentierkunst", J. A. Barth-Verlag Leipzig (1964) 980) az N-glikozid 10 perces — 10 napos állása során megy végbe — előnyösen 0,5-3 nap, 0 *C - 200 *C hőmérsékleten, különösen 40 — 70 °C hőmérsék-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 6Q V 3
