198796. lajstromszámú szabadalom • Eljárás anioncserélő hordozólapok előállítására és szilárdfázisú eljárás és berendezés nukleinsavfragvensek szekvenciájának megállapítására
HU 198796 B 12 ciónak megfelelően. Jelen esetben az ötféle oligonukleotidhez összesen 5 x 4 = 20 Eppendorf-kupak szükséges. A kővetkező reagenseket adagoljuk pipettával az egyes kupakokba:- a G-reakcióhoz: - 200 pl kakodilál--pufferl (pH = 8) vagy 200 /ul ammónium-formiát-puffert (pH = 3,5),- 1-2 pl DMS-t; - Az A+G-reakcióhoz: - 80 pl 88%-os hangyas&vat;- a T+C-reakcióhoz: - 80 pl 10"4 mól-os KMn04-oldatot, amelyet nem sokkal a felhasználás előtt 10'2 mól-os törzsoldatból állítottunk elő;- a C-reakcióhoz - 40 pl 4 mól-os hidroxil-amin oldatot (pH = 6), amelyet hidroxil-amin-hidrokloridból trietil--aminnal állítottunk elő. A G-reakció időtartama 10 perc, a többi reakcióé 20 perc. Az említett reakciókon kívül alkalmazhatjuk még a T+C-reakciót ozmium-tetroxiddal (80 pl 5 mmól-os 0s04-oldat + 1 pl piridin, 15 perc 0 °C-on), az A+G-reakciót piperidin-formiáttal (80 pl piperidin-foriniát (pH = 2), 1 óra 37 °C-on) vagy dielil-pirokarbonáttal [150 pl A-puffer (50 mmól-os nétrium-acetát (pH = 5) + 1 mmól-os EDTA) + 5 - 10 pl frissen késziteLt, etanolos, 10%-os. dielil-pirokarbonát oldat, 20 perc 90 °C-on] A Maxam és Gilbert szerinti T+C- és C-reakció hidrazinnal illetve az A+G-reakció 1,2 mól-os NaOH-oldattal a radioaktivitás teljes elvesztéséhez vezet, ezért nem alkalmazhatók. A fenti modifikációs reakciók során a kővetkező veszteségek lépnek fel: 20% a G- 50% az A+G-, 0% a T+C- és 50 - 80% a C-reakcióban. Ezeket a veszteségeket az A+G- illetve a C-reakeióban kétszeres vagy négyszeres radioaktivitással egyenlítjük ki. A modifikációs reakciókat azzal fejezzük be, hogy csipesszel kiemeljük a papír darabkákat a reaktor edényekből és kétszer vízzel és elanollal kimossuk. 4. Piperidin-reakció a DNS-fonaltöredékek előállítására és a fragmenseknek a hordozóból történő egyidejű editálására A 20 db papír hordozó lapot egyenként 20 db új Eppendorf-kupakba helyezzük. 50 pl 10%-os vizes piperidin-oldat hozzáadása után 80 percig 90 °C hőmérsékleten termosztáljuk a kupakokat. A reakció befejezése után a papír darabkákat csipesszel kiemeljük az Eppendorf-kupakokból, az oldatokat 1 11 percig -200 °C hőmérsékleten, például folyékony levegőben tartjuk majd kb. 1 órán át liofilizáljuk. A liofilizációs lépést 10 - 20 pl víz hozzáadásával kétszer megismételjük (kb. 30 - 30 perces időtartammal). A minták így készek a gélelektroíorézÍ6hez történő felhordásra. A fenti öli gonukleotidek autoradiogramjai a 7. és 8. ábrán láthatók. 12. példa Nagyszámú cligonukleotid manuált egyidejű szék ven tálasa reagens-fölösleg gél reaktor edényben Az ötféle pentadekanukleotid, a d(TTCTTCTAGCACACCC), a d(TGATCAGATGGCTTT), a d(CTCCTGGCCATTCCT), a d(GGGTACCCAGAAGTC) és a d(TCGCTGAGATCACCA) jelzése és megkötése a 11. példa 1. és 2. pontjában leírtakhoz hasonlóan történik. A kémiai modifikációs reakciókat azonban csak 4 db Eppendorf-kupakban végezzük, amelyek mindegyikében 5 db papír hordozólap van. A reakciókörülmények és mosási műveletek azonosak a 11. példa 3. pontjában leírtakkal. A mosás és a szárítás után a műveletek megkezdése előtt megjelölt hordozó lapokat átcsoportosítjuk úgy, hogy egy csoportba kerüljön'az azonos oligonukleolidet tartalmazó 4 db papír, és ilyen csoportosításban tudjuk a piperidinreakcióhoz egyenként új Eppendorfkupakokba helyezni azokat. A piperidinreakciót a 11. példa 4. pontja szerin hajtjuk végre. A fenti oligoni, kleolidek autoradiogramjai a 9. ábrán láthatók. 13. példa Nagyszámú cligonukleotid manuális, egyidejű szekvenlélása reagens-fölösleggel reaktor edényben A 12. példában említett ötféle pentadekanukleotid jelzése a 11. példa 1. pontjában leírlak szerint történik. A fragmensek megkötése jelen esetben nem 4 x n (n = 5), tehát 20 db 2x2 mm nagyságú, hanem 4 db 2 x 20 mm nagyságú hordozó lapon történik úgy, hogy kb. 1-2 pl-t csöppentünk fel kb. 2x2 inm-es felületre oligonuklcotidenként és egy hordozó lapra visszük fel mind az öt oligonukleolidet. A 4 db nagyobb hordozó lapot megfelelően nagyobb reaktor edényekben a már leírt modifikációs reakcióknak vetjük alá. A hordozó lapok mosása és szárítása után a 4 db 2 x 20 mm nagyságú lapot ollóval 5 db kisebt' (2x2 min-es) darabra vágjuk szét és a piperidin-reakcióhoz összesen 20 Eppendorf-kupakba helyezzük egyenként. A piperidin-reakció és a liofilizálás az előzőekben leírtak szerint történik. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
