198741. lajstromszámú szabadalom • Eljárás citorodin S származékok, valamint ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
17 HU 198741 B 18 vittük át, vagy határhígításos módszerrel klónoztuk. Az így kapott fuzionált sejteket ugyanazon törzsből származó, előzetesen 0,5 ml tetrametil-pentadekármal kezelt egerek hasüregébe transzplantáltuk. A transzplantálás után egy-két héttel néhány ml hasűri folyadékot vettünk, amely homogén monoklón antitestet tartalmazott 5-10 mg/ml koncentrációban. Az így kapott monoklonális, CEA (MA 204) elleni antitest citorodin S komplexét a 3. példa szerinti módon készítettük. Citorodin S immunoglobulin komplex rákellenes aktivitásának vizsgálata 96 lyukú mikrolemezen elosztottunk 200 pl 5xl04 sejt/ml koncentrációjú L1210 tumor sejtvonalat, amelyet RPMI 1640-10% fetal borjúszérum tápközegben tenyésztettünk (lxlO4 sejt/lyuk). A sejttenyészethez hozzáadtunk lyukanként 10 pl citorodin S-t (CYT) és citorodin S immunoglobulin-komplexet (CYT-nyúl IgG). Az elegyet 37 °C-on 6 óra hosszat inkubáltuk. Ezután hozzáadtunk 25 pl tríciummal jelzett timidint 0,5 pCi/lyuk koncentrációban, és az elegyet 37 °C-on 6 óra hosszat inkubáltuk. Ezután a sejteket sejtszúrön összegyűjtöttük, szárítottuk és folyadék szcintillációs számlálóval meghatároztuk a beépült jelzett timidint, a sejt DNS-szintetizáló aktivitásának összehasonlítása céljából. Az eredményeket a 4. ábra mutatja. Az ábrából kitűnik, hogy a CYT-nyúl IgG-ben lényegében véve megmaradt a CYT rákellenes aktivitása. Hasonlóképpen vizsgáltuk a citorodin S származékot (citorodin S-anti CEA monoklonális antitest komplex) Colo 205 esetén, amely CEA-termeló sejt. Az eredményeket az 5. ábra mutatja. A használt teszt-anyagok menynyisége a következő: minta hatóanyag/antitest arány CYT 0.2 jug/ml CYT-MA 204* ** 0.2 Mg“/6.3 Mg/ml 4:1 CYT-rab IgG 0.2 Mg*/12.5 Mg/ml 2:1 MA 204* 0.5 Mg/ml Sejt Colo 205, 5xl04/lyuk * MA 204: anti CEA monoklonális antitest **CYT aktivitás egyenértéket jelöl (CYT eq) Mivel az MA 204 szelekciós fajlagossága nagyobb, mint a Rab IgG, az 5. ábrán látható, CYT-MA 204-hez tartozó, a CAT-Rab IgG-hez tartozónál nagyobb növekedésgátló aktivitás arra utal, hogy a találmány szerinti citorodin S immunoglobulin-komplex szelektíven hat a rákos sejtekre. Összehasonlítás az aklacinomicin-immunoglob ulin-komplexszel Összehasonlításképpen az (X) képletű aklacinomiciri A immunoglobulin-komplexét állítottuk elő, a 3. példa szerinti módon. Az aklacinomicin A szerkezetileg hasonló a citorodin S-hez. Mig a citorodin S-t antitest molekulánként 5-12 molekula arányban adagoltuk, az aklacinomicint antitest molekulánként 2 molekula mennyiségben adtuk. A két antitest komplex L1210 esetén kifejtett DNS-szintetizálás gátló aktivitását a sejtekbe beépített tríciummal jelzett timidin mennyiségével mértük. Az eredményeket a 6. ábra mutatja. Az ábrából kitűnik, hogy a citorodin S komplex aktivitása magasabb, mint az aklacinomicin komplexé. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás (I) általános képletű citorodin S származékok előállítására - ahol X jelentése -NII2, -NH-R3-COOH, -NH-R1- -SH, -NH-RZ-COOCHz-CHs, (a), (f), (g) -NH-Rz-CO-NH-(IgG)i/n vagy -NH-R3- -CO-NH-(IgG)i/n általános képletű csoport, ahol R1 1-4 szénatomos alkiléncsoportot jelent, R2 1-5 szénatomos alkiléncsoportot jelent, R3 1-7 szénatomos, adott esetben tiovagy aminocsoporttal helyettesített alkiléncsoportot jelent, IgG immunoglobulin maradékot jelent, n egész számot képvisel, értéke 1-15 -, azzal jellemezve, hogy a) olyan (I) általános képletű vegyületek előállítására, ahol X jelentése -NH2, (a), (g) vagy -NH-R2-CO-NH-(IgG)i/n általános képletű csoport, (II) képletű citorodin S-t alkálifém-ciano-bór-hidriddel ammóniumsó jelenlétében redukálunk, így olyan (I) általános képletű vegyületet kapunk, ahol X jelentése -NH2 képletű csoport, amelyet kívánt esetben egy (III) általános képletű maleimid-származékkal reagáltatunk - ahol R2 jelentése a fenti -, így olyan (I) általános képletű vegyületekel kapunk, ahol X jelentése (a) általános képletű csoport, amelyet kívánt esetben egy (IV) általános képletű immunoglobulin-származékkal reagáltatunk - ahol R2 és IgG jelentése a fenti, n’ egész szám, éltéke 1-20 -, így olyan (I) általános képletű vegyületekel kapunk, ahol X jelentése (g) vagy -NH-RZ-CO-NH-ÜgGh/n általános képletű csoport, vagy b) olyan (I) általános képletű vegyületek előállítására, ahol X jelentése -NH-R^SH vagy (f) általános képletű csoport, a (II) képletű citorodin S-t alkálifém-ciano-bór-hidriddel egy Nl^R'-SH képletű vegyület 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 11
