198741. lajstromszámú szabadalom • Eljárás citorodin S származékok, valamint ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
11 HU 198741 B 12 és a reakcióelegyet 25 °C-on 5 percig állni hagytuk. A reakcióelegyet ezután PD-10 oszlopon (Pharmacia gyártmány) frakcionáltuk, az oszlopot előzetesen EDTA-t tartalmazó 50 mmól/l-es foszfát-puffer-oldattal (pH=7,5) kiegyensúlyoztuk. így az immunoglobulin SATA származókét kaptuk. A SATA származékhoz 0,25 mmól/1 EDTA-tartalmú 0,5 mmól/1- -es vizes hidroxil-amin-oldatot (pH=7,5) adtunk, amely a SATA 50 mólegyenértékének felel meg. Az elegyet 25 °C-on egy óra hoszszat veagáltattuk, a dezacetilezés elvégzésére. A fenti, SH csoportokat tartalmazó immunoglobulin vizes oldatához az SH csoportok 10-szeres egyenértékének megfelelő citorodin S GMBS származékot adtunk 20 pl dimetil-formamidban, és az elegyel 5 °C-on 12 óra hosszat reagóllaltuk. A reakció befejezése után a reakcióelegyet 20 mm x 400 mm méretű Sephadex G-25 (Pharmacia gyártmány) oszlopon frakcionáltuk, amelyet előzetesen 1 mmól/1 EDTA-t tartalmazó 50 mmól/l-es foszfát-puffer-oldattal (pH=7,5) egyenlítettünk ki. A 160 000 globuláris proteinnek megfelelő frakciókat elválasztottuk. Az eluáluinot 280 nm-nél és 495 nm-nél vizsgáltuk a citorodin S és protein frakciók azonosítására. Az így kapott citorodin S - nyúl immunoglobulin-komplexet, amely megfelel olyan (I) általános képletű vegyületnek, ahol X jelentése (g) képletű csoport, dialízissel sótalanitottuk és liofilizáltuk, igy 20 mg terméket kaptunk. Az immunoglobulin molekulánként megkötött citorodin S mennyiségét a 495 nm-nél mért, citorodin S-re specifikus abszorpció és a komplex száraz tömege alapján számítottuk, és úgy találtuk, hogy egy molekula immunoglobulin 5 molekula citorodin S-t kötött meg. Továbbá, 12 molekula citorodin S-t lehetne megkötni a SATA mennyiségének növelésével. A 3. ábra a komplex UV spektrumát mutatja, amelyben egy molekula immunoglobulin kb. 12 molekula citorodin S-t kötött meg. A komplex UV spektrumai azt mutatják, hogy amennyire a megkötött citorodin S aránya növekszik, annyira növekszik a citorodin S abszorpciós maximuma. 4. példa 5 mg citorodin S 1 ml metanollal készült oldatához hozzáadtunk 2,6 mg ^-amino-vajsav 1 mg/ml-es metanolos oldatát, amely megfelel 6 mólnak citorodin S mólonként. Miután az oldat pH-ját trietil-aminnal 8-ra állítottuk, hozzáadtunk 1,4 mg nátrium-ciano-bór-hidridet, amely megfelel 3 mólegyenértéknek. Az elegyet 25 °C-on 24 óra hosszat reagéltattuk. Az így kapott reakcióelegyet TLC-vel vizsgáltuk a termék jelenlétére, majd HPLC-vel elemeztük a tisztaságot és tisztítottuk. A TLC Rf értéke, ugyanolyan körülmények között, mint a 2. példában, citorodin S: 0,57, ^-amino-vajsav-szérmazék: 0,28. A HPLC-ben a retenciós idő, ugyanolyan körülmények között, mint a 2. példában, citorodin S: 36 perc, ?-amino-vajsav-származék: 29 perc. HPLC-vel végzett tisztítással, ugyanolyan körülmények között, mint a 2. példában, kb. 1,5 mg K-amino-vajsav-származékot kaptunk, A tömegszám meghatározása FAB/MS spektrométer (JMS-DX300) segítségével 1028 (M+H*) tömegspektrumot adott, amely megfelel a számított tömegszémnak. Emellett a származék abszorpciós spektruma jól megtartotta a citorodin S antraciklin gyűrűjének a 495 nm-nél megjelenő specifikus abszorpcióját. 5. példa 2,5 mg citorodin S i;-amino-vajsav-szórmazéka 50 mg/ml-es DMF-es oldatához hozzáadtuk 515 pg diciklohexil-karbodiimid DMF-fel készült 50 mg/ml-es oldatát, amely a citorodin S ekvimoláris mennyiségének felel meg. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten 1 óra hosszat reagéltattuk. 20 mg nyúl immunoglobulin (Sigma gyártmány) 1 ml 50 mmól/l-es foszfát-pufferrel (pH=7,5) készült oldatához hozzáadtuk a fenti, citorodin S származék DMF-es oldatot. Az elegyet szobahőmérsékleten 30 percig reagáltattuk. A citorodin S K-amino-vajsav-származéka megfelel a nyúl immunoglobulin 20 mólegyenértékének. Ezután gyorsan hozzáadtunk 1 mól/1 trisz-hidroklorid-puffert (pH=7,8), a reakcióelegyet kevertük, majd 10 percig állni hagytuk. A kapott anyagot PD-10 oszlopra (Pharmacia gyártmány) vittük fel, amelyet előzőleg 50 mmól/l-es foszfát-pufféi— rel egyensúlyoztunk ki. A kapott komplex megfelel az (I) általános képletnek, ahol X jelentése -NH-R3-CO-NH-(.TgG)i/n, ahol n értéke 12. 6. példa 5 mg citorodin S 1 ml metanollal készült oldatához hozzáadtuk 3,3 mg lizin 1 mól/l-es vizes ecetsavval készült 10 mg/ml koncentrációjú oldatát, amely a citorodin S 6 mólegyenértékének felel meg, és 14 mg nétriura-ciano-bói— hidridet, amely 3 mólegyenértéknek felel meg. Az elegyet 25 C-on 24 óra hosszat reagéltattuk. A kapott reakcióelegyet, a termék jelenlétének ellenőrzése után, HPLC-vel tisztaságra nézve vizsgáltuk, majd tisztítottuk. A lizin-származék Rf értéke ugyanolyan körülmények között, mint a 2. példában 0,20. A lizín-származék retenciós ideje HPLC-ben ugyanolyan körülmények között, mint a 2. példában, 27 és 28 perc. HPLC-vel végzett tisztítás, ugyanolyan körülmények között, mint a 2. példában, kb. 2,6 mg lizin-származékot eredményezett. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
