198734. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rezofurin szk-ok glikozidjainak előállítására, eljárás glikozidázok és szacharid láncokat hasító enzimek aktivitásának meghatározására és diagnosztikumok enzimek kimutatására

1

HU 198734 B

2

Rezorufinil-glikozidok jellemző adatai:

Cukor

Kitermelés

(%)

HPLC rt/ /izopropanol (%)

Rf szilikagél) butanol/ecetsav/ /víz = 50/15/25

maltotrióz*

15

3,52 perc/17%

0,32

maltotelraóz

16

3,27 perc/17%

0,29

maltopentaóz

14

2,95 perc/17%

—

maltoheptaóz

10

2,60 perc/17%

—

maltóz5

15-0,39

15

a) A rezorufiníI-/3-D-maItotrióz esetében a

Diaion oszlop eluálását 25%-os izopropanollal, az RP-18 oszlopon a kromatografálást pedig 25%-os izopropanollal végezzük. u

b) A rezorufmil-/?-D-maltozid esetében a Diaion oszlop eluálását 40%-os izopropanollal végezzük. A terméket vákuumban szárazra pároljuk, majd DMF-ben oldjuk és a terméket vízzel kicsapjuk. A csapadékot leszívatjuk és vákuumban szárítjuk.

‘H-NMR (DMSO-d6): maltóz= 3,1-3,9 (m,

11H, OH, H-6); 4,4-5,7 (m, 10H, H-l-H-5);

6,2 —8,0 (m, 6H-ArH); maltotrióz: 3,0-5,9 (m,

32H, OH, H-1-H6); 6,2-8,0 (m, 6H, ArH). 30

22. példa

Rezorufinil-u-D-mannopiranozid

2,13 g (10 mmól) rezorufint és 2,75 g (10 mmól) ezüstkarbonátot 100 ml acetonilrilben szuszpendálunk és a szuszpenziót nedvesség és fény kizárása mellett 12 órán át szobahőmérsékleten kevertetjük. Végül hozzáadjuk 4,11 g (10 mmól) aceto-bróm-a-D-mannóz 70 ml acetonit- 40 rillel készített oldatát és az elegyet 1 órán át viszszafolyató hűtő alatt forraljuk. Lehűlés után a nem oldódott anyagot szűrjük, a szűrletet rotációs bepárlón bepároljuk és szilikagélen kromatografáljuk (szilikagél 60, Merck Darmstadt; futta- 45 tószer: kloroform:tetrahidrofurán 10:1); Rf =

0,3.

A rezorufinil-a-D-mannopiranozid-tetraacetát kitermelése: 0,5 g (9%).

0,5 g rezorufinil-u-D-mannopiranozid-tetra- 3 acetáthoz fény kizárása mellett és kevertetés közben részletekben hozzáadunk egy oldatot, amely 0,10 g nátrium-metilátot tartalmaz 50 ml metanolban oldva. A teljes átalakulás után (ellenőrzés vékonyrétegkromatográfiával) a kivált narancssárga rezorufinil-a-D-mannopiranozid csapadékot szűrjük és metanolból kristályosítjuk.

Vékonyrétegkromatográfia: szilikagél 60

(Merck, Darmstadt); futtatószer etilacetát/izo- „ propanol/víz 9/4/2; Rf = 0,5. A rezorufinil-a-D- mannopiranozid kitermelés: 0,3 g (88%). A CjgHpNOg képletre:

számított: C: 57,60, H: 4,57, N: 3,73%; talált: C: 57,42, H: 4,66, N: 3,66%.

23. példa

Rezorufinil-béta-D-glukuronid

2,13 g (10 mmól) rezorufint és 2,75 g (10 mmól) ezüst-karbonátot 100 ml acetonitrilben a nedvesség és a fény kizárása mellett 12 órán át szobahőmérsékleten kevertetünk. Végül az oldathoz hozzáadunk 3,97 g (10 mmól) aceto-bróm-glukuronsav-metilésztert 70 ml acetonitrilben oldva és a reakcióelegyet először 4 órán át szobahőmérsékleten, majd 6 órán át 50 °C-on kevertetjük. Lehűlés után a fel nem oldódott anyagot centrifugálással elkülönítjük, az oldatot rotációs bepárlón betöményítjük és a nyersterméket metanol hozzáadásával kicsapjuk. A tisztítást szilikagél-oszlopkromatográfiával végezzük (Kieselgel 60, Merck, Darmstadt; eluálószer: tetrahidrofurán:kloroform 1:10; Rf = 0,4).

Kitermelés a rezorufinil-béta-D-glukuronsav-metilészter-triacetátra vonatkoztatva: 0,8 g (15%).

Dezacetilezés céljából 0,5 g rezorufinil-béta-D-glukuronsav-metilészter-triacetálot kb. 20 ml nátrium-metilát oldatban szuszpendálunk (ezt 0,5 g nátriumból és 40 ml metanolból állítjuk elő) és a reakció teljes lezajlásáig (kb. 1 óra, vékonyrétegkromatográfiás ellenőrzés mellett) szobahőmérsékleten kevertetjük. Semlegesítés után a kivált csapadékot szűrjük és metanolból átkristályosítjuk. Vékonyrétegkromatográfia: Kieselgel 60, Merck, Darmstadt. Eluálószer: etilacetát:metanol 3:1; Rf = 0,7.

Kitermelés a rezorufinil-béta-D-glukuronsavmetilészterre vonatkoztatva: 0,3 g (79%).

0,2 g rezorufinil-béta-D-glukuronsav-metilésztert 40 ml metanol és 2 ml 0,1 M nátrium-hidroxid elegyében szuszpendálunk és az észter teljes hidrolíziséig (kb. 15 óra, vékonyrétegkromatográfiás ellenőrzés mellett) szobahőmérsékleten kevertetjük. A pH érték ennek során

12,5 — 13 kell, hogy legyen. A nyersterméket szűrjük és Sephadex LH 20 oszlopon (eluálószer: víz) tisztítjuk. Vékonyrétegkromatográfia: Kieselgel 60, Merck, Darmstadt; eluálószer: etil-acetát:metanol 1:1; Rf = 0,4. Kitermelés a rezorufinil-béta-D-glukuronidra vonatkoztatva:

15