198734. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rezofurin szk-ok glikozidjainak előállítására, eljárás glikozidázok és szacharid láncokat hasító enzimek aktivitásának meghatározására és diagnosztikumok enzimek kimutatására
1 HU 198734 B 2 A találmány tárgya eljárás rezofurin-származékok glikozidjainak előállítására, eljárás glikozidázok és szacharid-láncokat hasító enzimek aktivitásának meghatározására és diagnosztikum enzimek kimutatására. A glikozidázok mind az emberek, mind az állatok szervezetében sokféle fiziológiai funkciót töltenek be. így pl. a /?-D-galaktozidáznak a szénhidrát-anyagcsere folyamatában van fontos szerepe, minthogy általa a laktóz hidrolízise következik be. Ezen túlmenően a /?-D-galaktozidáz kulcsenzim a glikoproteidek, a mukopoliszacharidok és a glikoproteinek lebontásánál. Fiziológiai szempontból jelentős további glikozidázként még az a-D-galaktozidázt, az a-D- és a /3-D-glükozidázt, valamint az a-D-mannozidázt nevezzük meg. Fiziológiai értékük miatt a glikozidázok fontossága és jelentősége az utóbbi években mind a diagnosztikai, mind a biotechnológia területén megnőtt. így például a nevezett enzimeket egyre nagyobb mértékben alkalmazzák indikátorenzimként az úgynevezett "enzimimmunoassay" eljárásokban. Ebben a vonatkozásban különösen a 0-D-galaktozidáz használata előnyös [lásd például: annals of Clinical Biochemistry, 16, 221-240(1979)]. A glikozidázok aktivitásának meghatározása ennélfogva mind a klinikai kémiában, mind a diagnosztikában egyre fokozódó jelentőségű. Egészen általánosan ezt a meghatározást úgy végzik, hogy a glikozidázt tartalmazó próbamintát egy alkalmas szubsztrátummal elegyítik, amikor is az enzim hasítja a szubsztrátumot. Ezután valamelyik hasítási terméket alkalmas módon meghatározzák. Akár az enzim hatására felszabaduló glikont, akár az aglikont lehet mérni, de rendszerint az utóbbit szokták meghatározni. Szubsztrátumként gyakran a meghatározandó enzimnek megfelelő természetes szubsztrátum kerül alkalmazásra, de különösen előnyös módon olyan glikozidokat használnak, melyek aglikonja valamilyen spektroszkópiai úton könnyűszerrel kimutatható maradék. Számos glikozidáz-szubsztrátum ismert, melyekből a megfelelő glikozidázzal végzett hasítás után olyan aglikont kapnak, melyet mind a látható fény, mind az UV-fény tartományban spektroszkópiával vagy fluorometriával mérni lehet. így a Biochem. Z. 333, 209 (1960) irodalmi helyen a /v-D-galaktozidáz szubsztrátumaként a fenil-/?-D-galakl< időt és ennek az aromás gyűrűn helyettesített további származékait (mint például az o-nitro-fenil- és a p-nitro-fenil-/?-D- galaktozidot) ismertetik. A hidrolízissel felszabadult fenolokat az UV-tartományban fotometriásan határozzák meg, illetőleg a nitro-fenolokat a látható fény hullámhossz-tartományban a rövidebb hullámhosszakon, ugyancsak fotometriás módszerrel mérik. Indikálásra még az aminoantipirinnel történő oxidativ kapcsolási reakciót is alkalmazni lehet [Analytical Biochem. 40, 281 (1971)). Hisztokémiai vizsgálatokhoz naftalin-/?-D-galaktozidokat alkalmaznak, így például használják az 1-naftil-vegyületet [Histochemie, 35, 199 (1973)], a 6-bróm-2-naftil-származékot [J. Bioi. Chem., 195, 239 (1952)] vagya naftol-0-D-galaktozidot [ Histochemie, 37, 89 (1973)]. A láthatóvá tétel érdekében a keletkezett naftolokat különféle diazóniumsókkal reagáltatják és így azokat azoszínezékké alakítják át. Az enzimaktivitások fluorogén szubsztrátummal végzett meghatározása széles körben elterjedt, mivel a fotometriás módszerekhez képest a fluoromét riás meghatározás gyakran egy-két nagyságrenddel nagyobb érzékenységet biztosít. Bizonyos esetekben feltétlenül fluorogén szubsztrátumokat kell alkalmazni. Ez a helyzet pédlául az enzimatikus aktivitás sejtekben történő vizsgálatánál, melyet sejtdifferenciálás végett automatikus berendezésekben végeznek (citofluorometria), illetve az immobilizált enzimek úgynevezett átfolyásos mikrofluorometriás analízisénél. Más esetekben, így például kísérleti rendszerek enzimatikus megjelölésének meghatározásánál (enzimimmunoassay) az enzimatikus katalízis multiplikációs effektusát jelentősen meg lehet erősíteni a fluorogén szubsztrátumok alkalmazásával. A /J-D-galaktozidázhoz és másféle glikozidázokhoz eddig ismertté vált fluorogén szubsztrátumok fluorofor-része valamilyen fluoreszcein-, indoxil- vagy metil-umbelliferon-származék. Komplex rendszerek kinetikus analizálásánál azonban az említett vegyületeknek többféle, komoly hátrányuk van. A fluoreszcein diszubsztituált származékai többfokozatú reakciósorozat szerint hidrolizálódnak. A monoszubsztituált fluoreszcein-glikozidok már önmagukban fluoreszkálnak. Az indolszármazékok az enzimatikus hasítás után számos kémiai változáson esnek át, ami a kinetikus analízist ugyancsak komplikálja. A melil-ubelliferon-származékokat az UV-tartományban kell gerjeszteni és ennél a biológiai eredetű vagy szintetikusan előállított anyagok saját fluoreszcenciája zavarokat okozhat. Mindezeken túlmenően az ultraibolya fénynyel végzett gerjesztés — különösen lézeroptika alkalmazásával — eléggé költséges. A legtöbb fluorogén szubsztrátumból olyan reakciótermékek keletkeznek, amelyek csak mérsékelt oldhatósággal rendelkeznek. így ezek nem alkalmasak a különféle enzimaktivitások kinetikus analíziséhez, minthogy ehhez kifejezett követelmény, hogy a szubsztrátum és a termék oldhatósága jó legyen. Mindezek miatt továbbra is szükség van az olyan szubsztrátumokra, melyekkel a különféle glikozidázokat egyszerűen, gyorsan és megbízhatóan meg lehet határozni, emellett az ilyen szubsztrátumoknak lehetőleg mind a fotometrikus, mind a fluorometrikus mérési eljárásokhoz alkalmasnak kell lenniök. A találmány célkitűzése az volt, hogy ezt a szükségletet kielégítse. A fenti feladatot rezorufin-származékok új glikozidjaival oldottuk meg, amelyeket glikozidázok segítségével cukorrészre és rezorufinszármazékra lehet hasítani. Az utóbbiak vízben jól oldható vegyületek és a látható tartományban 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
