198723. lajstromszámú szabadalom • Eljárás makrolid vegyületek és ilyen vegyületeket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
1 HU 198723 B 2 cukor hasznosítás D-glükóz + + L-arabinóz 4 + D-xilóz 4 izo-inozit 4 4 D-mannit 4 4 D-fruktóz 4 4 L-ramnóz 4 4 szacharóz 4 4 raffinóz kontroll — 4 4 jó hasznosítás; 4 hasznosítás; - nincs hasznosítás. 4. Sejtkomponensek A SANK 60286 törzs sejtfalát Becker, B. és munkatársai által az Applied Microbiology, 12. 421 (1964) szakirodalmi helyen ismertetett módszerrel vizsgálatnak vetettük alá. Minthogy L,L-diamino-pimelinsavat és glicint ki tudtunk mutatni, a sejtfal I. típusú sejtfalnak tekinthető. Ezután a teljes sejtek cukor-komponenseit vizsgáltuk a Lechevalier, M. P. által a Journal of Laboratory and Clinical Medicine, 71. 934 (1968) szakirodalmi helyen ismertetett módszerrel. Nem találtunk jellegzetes eloszlást. Összefoglalóan megállapítható volt, hogy a törzs az Actinomycetesekhez tartozó Streplomyces genuszba tartozik. A SANK 60286 törzs azonosítását az 1SP (The International Streptomyces Project); Bergey’s Manual of Determinative bacteriology, 8. kiadás; Waksman, S. A. "The Aclinomycetes" c. könyve és más, az Actinomycetesekkel foglalkozó legújabb publikációk alapján végeztük. Ha a SANK 60286 törzs tulajdonságait összehasonlítjuk a Streptomyces genuszhoz tartozó más ismert spccieszek tulajdonságaival, akkor megállapítható, hogy a morfológiai és fiziológiai tulajdonságai csaknem azonosak a J. Antibiotics, 36. 438 (1983) szakirodalmi helyen ismertetett Streptomyces hygroscopicus subsp. aureolacrimosus tulajdonságaival. A két törzs tenyésztési tulajdonságai között azonban kisebb különbség volt megfigyelhető. Jól ismert, hogy az Aclinomycelesek tulajdonsá gai változnak bizonyos mértékben néhány egymást követő tenyésztés után. ezért a törzsek nem mindig különböztethetők meg taxonómiailag tenyésztési tulajdonságokban jelentkező kisebb különbségekre tekintettel. Ilyen okokból a milbemicin an. «i2> a13. °14 és al5 anyagokat termelő SANK 60286 törzset Streptomyces hygroscopicus subsp. aureolaerimosus SANK 60286 törzsként azonosítottuk. A Budapesti Megállapodás előírásaival összhangban a törzset 1986. október 20-án deponáltuk a Fermentation Research Institute japán törzsgyűjteménynél, ahol az a FERM BP-1190 deponálási számot kapta. A törzs mintái a Budapesti Megállapodás vonatkozó előírásai értelmében hozzáférhetők lesznek. Az Actinomyceiesek, beleértve a Streptomyces hygroscopicus subsp aureolacrimusos SANK 60286 törzset, hajlamosak mutációt szenvedni mind természetes okokból, mind mesterséges kezelés, például ibolyántúli sugárzás, röntgensugárzás vagy kémiai kezelés hatására. A találmány oltalmi körébe tartozónak tekintjük a SANK 60286 törzs összes termelőképes mutánsát. Ezek közé a mutáns törzsek közé tartoznak a génmanipulációval, így például rekombinálással, transzdukcióval és transzformálással kapott mutánsok. Más szavakkal, a találmány oltalmi körébe tartozik minden olyan törzs, amely a milbemicin un, a13 és a[4 közül egy vagy több előállítására képes, és különösen az olyan törzsek, amely nem különböztethetők meg egyértelműen a SANK 60286 törzstől vagy annak mutánsaitól. A milbemicin ajj, <*13 és 014 előállítható a SANK 60286 törzset egy alkalmas közegben tenyésztve és a közegből a milbemicineket elkülönítve. A Streptomyces genuszba tartozó mikroorganizmusok tenyésztésére szokásosan használt anyagok használhatók fel tápanyagként, így például szénforráskénl használhatunk glükózt, szacharózt, keményítőt, glicerint, sűrű malátaszirupol, melaszt vagy szójaolajat. Nitrogénforráskenl megemlíthetjük például a szójalisztet, búzacsírát, húskivonatot, peptont, élesztősejteket, kukoricalekvárt, ammónium-szuifátot és a nátriumnitrátot. Kívánt esetben használhatók a mikroorganizmusok növekedését elősegítő és milbemicin a||, a|3 és a|4 makrolidok képződését aktiváló szervetlen és szerves adalékok megfelelő kombinációban, továbbá szervetlen sók, így például kalcium-karbonát, nálrium-klorid, kálium-klorid és foszfátok. '\ Az antibiotikumok előállítására hagyományosan alkalmazott módszerekhez hasonlóan a találmány szerinti mikroorganizmust is folyékony táptalajon, a leginkább célszerűen szubmerz tenyésztéssel tenyésztjük, aerób körülmények közölt. A tenyésztés célszerű hőmérséklete 22 °C és 30 °C közötti, a legtöbb esetben 28 °C körüli hőmérsékleten dolgozunk. Rázatásos tenyésztés vagy tartályos tenyésztés esetében a milbemicin án, <*13 és a |4 termelése jellegzetesen 5 — 15 nap elteltével ér el maximumot. A milbemicin au, «13 és aí4 termelése a következőképpen követhető. A tenyészetből vett 1 ml-es mintát betöltjük kis méretű kémcsőbe, majd 9 ml 80%-os vizes metanolt adunk hozzá. A kémcsövet rázatjuk, majd centrifugáljuk. Ezután nagynyomású folyadékkromatografálást végzünk, e célra például a Senshu Co. japán cég által H —2151 ODS márkanév alatt szállított, 6 mm • 150 mm méretű, fordított fázisú oszlopot és a Hitachi japán cég által Model 655 márkanév alatt forgalmazott szivattyút használva. A mintából 5 jul-t injektálunk az oszlopba, majd 1,5 ml/peré átfolyási sebességgel acetonitril és víz 80:20 térfogatarányú elegyével futtatást végzünk. A milbemicin au, a 13 és a 14 megjelenését 240 nm-en dolgozó ibolyántúli detektorral érzékeljük és a mennyiségét például a Union Techn. Inst. cég MCPD — 350PC márkanevű adatfeldolgozó egységével határozzuk meg. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 9
