198569. lajstromszámú szabadalom • Új bioautográfiás eljárás antibiotikumok és bomlástermékeik aktivitásának meghatározására
1 HU 198569 B 2 A találmány tárgya antibiotikumok és bomlástermékei aktivitásának meghatározására szolgáló új bioautográfiás eljárás. A bioautográfia a biológiai és kromatográfiás módszer kombinációja és a vegyületek aktivitásának kimutatására szolgál. A bioautográfiásan mérhető anyagok legfontosabb csoportját az antibiotikumok képezik, melyek esetén a jelentősen eltérő kémiai sajátságok következtében ez az egyedüli módszer a papír- és vékonyréteg-kromatogramokon lévő aktív foltok detektálására. Bioautográfiával ily módon kimutathatók az aktív foltok, de az inaktív szennyeződések vagy bomlástermékek csak a réteg-kromatogramokon észlelhetők, amennyiben a vizsgálathoz a későbbiekben is alkalmazott 7,5 x 5 cm Kieselgel 60F254 aluminium lemezeket használjuk és ultraibolya fényben értékeljük. A biológiailag aktiv anyagok a mikroorganizmusokat tartalmazó agarban kioltási zónákat hoznak létre, amely folyamat jól észlelhetövé válik, ha az agarba az alkalmazott mikroorganizmuson kívül (pl.: E. coli, B. subtilis, Sarcina lutea, stb.) 2,3,5-trifenil-2H-tetrazólium-kloridot is keverünk. A mikroorganizmus a 2,3,5-trifenil-2H-tetrazólium-kloridot formazánná redukálja, Így az agar vörösbarna színűvé vélik, amely háttér mellett, az antibiotikumok hatására létrejött kioltási zónák igen jól értékelhetők. De ugyanígy alkalmazhatók egyéb trifenil-tetrazólium sók, továbbá a 2,6-diklórfenol-indolfenol is, ekkor a kioltási zónák kékek lesznek a színtelen háttérben. A vékonyréteg-kroinatogramok és a papír kromatogramok bioautográfiáját általában úgy végzik, hogy valamely módon a kromatogramokat agar lemezre viszik át, mely agar tartalmazza az alkalmas mikroorganizmust és célszerűen valamilyen indikátor anyagot is. Ezt követően az agar lemezt megfelelő inkubációs körülmények között tartják a mikroorganizmusok elszaporítása céljából. Azokon a helyeken, ahol antibiotikus aktivitás jelentkezik, ott a baktériumok növekedése nem tud végbemenni és ezeken a területeken kioltási zóna látható; ahol baktérium növekedés van az agar színe vörösbarna marad. Ilyen módszert ismertet a Gradinar, Lozar, Nauka, 14 (8) 37-7 (1977) (Ca. 90 81919g) című folyóirat különböző fungicidek, Penicillum törzsek elleni aktivitásénak meghatározására. Az eddig ismert eljárások alapvetően két csoportba oszthatók. Egyik csoportba tartoznak azok, amikor az agar lemezt, a kromatogramon in situ készítik el, a másik csoportba tartozók esetén az agar lemezt előre elkészítik és azt követően hozzák kontaktusba a kromatogrammal. Az eddig alkalmazott módszer szerint úgy járnak el, hogy a 20 x 20 cm nagyságú kromatográfiás lemezt nagyméretű, 21-34 cm-es, szögletes üveg vagy műanyag edény aljéra rögzítik, majd mintegy 100 ml inokulált agar szuszpenzióval fedik be. Ezt követően mintegy egy órán át hűtőszekrényben tartják, amikor is a kromatográfiás foltok diffúziója végbemegy, ezt inkubálás követi általában 30-37 °C-on, 16-24 órán át. Az előhívás elvégezhető oly módon, hogy valamely trifenil-tetrazólium sóval, előnyösen kloriddal lepermetezzük a lemezt - vagy úgyis, hogy eredetileg azt már az agarba bekeverjük. A másik eljárás szerint szintén nagyméretű (21 x 34 cm) edénybe 300 ml steril agart visznek be alapként. Ha az megszilárdult, arra 100 ml inokulált agart rétegeznek. Erre helyezik rá igen óvatosan a kifejlesztett kromatogramot. Ekkor mintegy 30 percen át 4 °C-on tartják a rendszert, a diffúzió végbemenetele céljából, ezt követően a kromatográfiás lemezt eltávolítják (ez a művelet technikailag igen nehezen hajtható végre), majd 18-24 órás inkubáció következik, célszerűen 30-37 °C-on. Mint az a leírtakból látható mindkét módszer szerint nagy mennyiségű inokulált agar kerül felhasználásra. Ez számos esetben azért jelent problémát, mert ezen fertőzött agarok patogén mikroorganizmusokkal is beoltásra kerülhettek. Az ilyen agar lemezek későbbi kezelése mennyiségük miatt is számos problémát hordoz, éppen fertőző voltuk következtében. Ugyanakkor a vegyületek detektálásához aránytalanul nagy a felhasznált mind steril, mind pedig inokulált agarok mennyisége. Célszerűnek tartottuk olyan módszer kidolgozását mely alkalmazásával jóval kevesebb agart kell felhasználni, ezáltal az adott esetben patogén mikroorganizmusokkal fertőzött agarok mennyisége is jelentősen lecsökken; ez a fertőzési veszélyt is minimálisra redukálja. Módszerünk kidolgozásánál szem előtt tartottuk, hogy annak kivitelezhetősége, felbontóképessége és pontossága semmivel se maradjon el a referens eljárások mellett. Módszerünkben az előnyösen alkalmazható kromatográfiás lemezek mérete mintegy 7,5 x 5,0 cm (Kieselgel 60F254). A bioautográfiés módszer alkalmazásához szükséges agar hőmérsékletét 50, °C-ra állítjuk be, majd annak minden 100 ml-éhez 0,02 g 2,3,5-trifenil-tetrazólium-kloridot és 2 ml 18 órás baktérium szuszpenziót adagolunk gondos kevertetés mellett. Az ily módon előkészített inokulált agárból 15-15 ml-t pipeltázunk Petri-csészékbe. Miután az agar a Petri-csészékben megszilárdult, amennyiben az szükséges, a kondenz vizet leszáritjuk róla, majd hordozóval lefelé ráhelyezzük az előzőleg elkészített, kifejlesztett réteg-kromatogramot, majd szélesztő bottal a lemez széleinek irányába rásimitjuk a réLeg felületét az agarra, hogy a légbuborékokat eltávolitsuk a lemez és az agar réteg körül. Ezt követően az agart a kromatográfiás lemez szélei mentén steril szikével körbe vágjuk, majd a lemezt i 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
