198514. lajstromszámú szabadalom • Eljárás proteinek renaturálására
1 2 az oldatból átalakulással felhasználódon denaturált proteint pótolni. Ez szakaszosan is történhet, amenynyiben az időket és kritikus koncentrációkat előre megadjuk, és azután mindig az intermedier képződésének végbemenetele után adjuk hozzá az ennek során átalakult denaturált proteinnek megfelelő ismert mennyiséget. Más módszer szerint az eljárás folytonosan is kivitelezhető, amennyiben mindig pontosan éppen annyi denaturált proteint adagolunk újból, amennyi hajtogatott intermedier újraképződésével fogy. Ezen a módon a renaturálás olyan körfolyamatban hajtható végre, amelynek során például a renaturálandó proteint valamilyen erre alkalmas oldószerben, így például erősen hígított sósavban oldva vagy liofilizált formában mindig olyan mennyiségben adagoljuk folyamatosan a renaturáló reaktorba, hogy az optimális renaturálási koncentrációt kapjuk. A renaturálási puffert egyidejűleg olyan összetételben adagoljuk folyamatosan, hogy a körülmények pH-érték, anyag-koncentrációk és hasonlók tekintetében konstansak maradjanak. A reaktor megfelelő kialakításával, ami lehet például hurokszerűen felépítve, és a protein és puffer hozzáadásának sebességével és mennyiségével meghatározott áramlási sebességgel olyan tartózkodási idő állítható be, ami a hajtogatott intermedier képződéséhez szükséges időnek felel meg. Ezután a reaktivált proteint folyamatosan elvesszük a rendszerből, például ultraszűrés, fordított ozmózis és hasonló műveletek segítségével történő elválasztással, és adott esetben ínatkív aggregátumokra és aktív proteinre választjuk szét. A folyamatos eljárást előnyösen úgy hajtjuk végre, hogy az elválasztott puffer-oldatot folyamatosan újból visszavisszük a reaktorba. A találmány szerinti eljárás folyamatos kivitelezése során előnyös, ha kezdetben a nem-folyamatos eljáráshoz hasonlóan a denaturált proteint az előbbiekben leírt módon addig adagoljuk, míg a renatnrált natív protein optimális koncentrációja beáll. Amint elérjük, megkezdjük a reaktivált protein vízonylag tömény oldatának folyamatos elvételét, és csak ezután váltunk át valóban teljes folyamatos eljárásra. A betöltési fázis, amelyben a reaktivált protein koncentrációja még emelkedik, ezért a tulajdonképpeni folyamatos kivitelezéshez élőiről kapcsolódik. Renaturáh protein optimális koncentrációján azt a lehető legmagasabb koncentrációt értjük, amelynél a reakcióriegy alkotórészeinek oldhatóságával még semmilyen problémák nincsenek. A találmány szerinti eljárásnál előnyösen liofilizált denaturált protemt használunk. Amennyiben viszont olyan protein) il van szó, amely csak lassan és nehezen vihető olda ba, akkor a hozzáadás oldott formában történik, hogg a találmány szerinti eljárás időbeli jellemzőit pontosan betarthassuk. A találmány szerinti eljárással ugyan a nem kívánt és a renaturálással konkurráló aggregátképződés minimalizálódik, de teljesen nem szorul vissza. A képződött inaktív aggregátumoknak azonban lényegesen magasabb molekulasúlya van, és ezért a renaturált proteinből könnyen eltávolíthatók olyan elválasztási módszerekkel, amelyek ezt a molekulasúly-különbséget használják ki, például molekulaszitás frakdonálással, adott esetben megfelelő kizárási határú ultraszűréssel, gradiens centrifugálással és hasonlókkal. Így elválasztott aggregátumok azután oldatbe* vitelük után ismét visszavihetők a renaturálási eljárásba. Renaturáló pufferekként az ilyen célra ismert összeállítások jönnek számításba. A pH-értéknek olyan pH-tartományon belül kell lennie, amelynél az illető protein jó stabilitású, célszerű közel a maximális stabilitás pH-értékénél lenni. A szennyezések, például nehézfémek denaturáló befolyásának kizárása céljából komplexképzők, például EDTA és hasonló vegyületek jelenlétében célszerű dolgoznunk. Így Íiéldául a laktát-dehidrogenáz esetében 6-8 pH-jú oszfát puffer használatos, amely körülbelül 1 mmól EDTA-t és 1 mmól DTE-t tartalmaz. Lizozim esetében gyengén lúgos= TRlS/HCl-puffer válik be, amely EDTA mellett valamilyen szulfhidrilcsoportot tartalmazó anyagot és kismennyiségű megfelelő diszulfidot tartalmaz. A szöveti piazminogén aktívától (tPA) renaturálására például a 3.537 708. számú német szövetségi köztársaságbeli szabadalmi bejelentésben leírt reaktiváló puffer megfelelő. Számos további protein esetében ismertek alkalmas renaturáló pufferek, vagy a proteinek ismert tulajdonságai, különösen a pH-stabilitás, szulfhidrilcsoport-tartalom, nehézfém-érzékenység és hasonlók alapján szakember néhány előkísérlet nyomán találhat ilyeneket. Ismert volt, hogy a renaturálás esetében bizonyqs koncentrádó-határértékeket nem szabad túllépni. Új az a felismerés, hogy nagyobb mennyiségű denaturált proteinhez esetleg nem szükséges nagyobb oldattérfogat alihoz, hogy nagyobb mennyiségű renaturált proteinhez jussunk, hanem ugyanabban az oldatban denaturált protein állandó újraadagolásával vagy egymást követő szakaszos újraadagolásával tovább dolgozhatunk és ezáltal lényegesen magasabb renaturált proteinkoncentrádóhoz juthatunk el, mint amit a technika jelenlegi állása lehetségesnek tart, A következő példák a találmányt részletesebben szemléltetik. 1. példa Lizozim adagolásos reaktiválása (Pulsreaktivierung) a) Az enzimoldatok előkészítése Koncentrádó-meghatározás (A: 1%-os oldat abszorpdója 280 nm-nél): natív lizozim. A=26,3 redukált lizozim: A= 23,7 A fajlagos aktivitás meghatározása: — 2 mg lizozimot 1 ml 0,066 niól/1 koncentrádójú, 6,2 pH-jú kálium-foszfát-oldatban oldunk, a koncentrádót ŰV-abszorpdóval határozzuk meg. — Vizsgálati oldat: 2,5 mg Micrococcus lysodeicticus sejtfalat szuszpendálunk 10 ml 0,066 mól/1 koncentrádójú, 6,2 j)H-jú kálium-foszfát-oldatban. — Vizsgálat 25 <T-on: 1 ml sejtfalszuszpenáó és 0,03 ml lizozim-oldat (1:40 előhígítás), a zavarosodás csökkentését 450 nm-en követjük nyomon. Fajlagos aktivitás= 60.000 (U/mg. Redukaó/denaturálás: — 500 mg lizozimot 3 óra hosszat inkubálunk 25 °C-on, 0,1 mól/1 koncentrádójú, 8,6 pH-jú TR1S/HC1+ + 6 mól/1 guanidin.HQ + 150 mmól/1 DTE (ditio-eritritol) elegy ben. — A pH-t 3-ra állítjuk, és a mintát szétosztjuk. 198.514 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
