198513. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antikoaguláns hatású peptid és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 2 198.5 í 3 ható hígítóanyagban, gyógyszerészetileg elfogadható hordozóanyagokkal együtt, amelyek lehetnek steril folyadékok, mint például víz vagy olajok, és a formált alakban kívánt esetben más felületaktív anyagokat és más gyógyszerészetileg elfogadható adalékanyagokat Is alkalmazhatunk. Alkalmazandó olajok például ásványolaj, amely állati növényi vagy szintetikus eredetű lehet és lehet például földimogyoróolaj, szójaolaj, és ásványi olaj. Folyékony hordozóanyagként különösen injektálható formált alak esetében előnyösen víz, fiziológiás sóoldat, dectróz oldat és hasonló cukoroldatok, etanol és glikolok, mint például propilén-glikol vagy polietilén-glikol alkalmazhatók. A találmány szerinti vegyületek mint tartalék injekció, vagy mint beültetett készítmény adagolhatók és olyan formában készítendők, amely lehetővé teszi az aktív hatóanyag fenntartott kibocsátását. Az aktív hatóanyag labdacsokká vagy kis hengerekké préselhető és szubkután vagy intramuszkulárisan beültethető, mint tartalék injekció vagy beültetett hatóanyag. A beültetett formált alakban inert anyagokat, mint például biológiailag lebontható polimereket vagy szintetikus szilikonokat, például Silastic-ot (egy szilikon gumi, amelyet a Dow-Croning Corporation állít elő) alkalmazhatunk. A találmány szerinti eljárást az alábbi példákon részletesen bemutatjuk. Kitermelés (monomer+dimer) > 901%. 1. példa r.„ ................ „r H-Gly-Asp-Phe-Glu-DCyS Ile-Pro-Cys-Glu-Tyr-Leu-Gln-OH előállítása A pepiidet. szilárd fázisú eljárással 0.1 mmól 0.66 mmólfg Boc-Gln-Pam gyanta alkalmazásával állítjuk elő. Kétszeres szimmetrikus anhidridet alkalmazó kapcsolást hajtunk végre 2.0 mmól Na-Boc-aminosav (Peptides International) alkalmazásával, kivéve hogy a Boc-Gln esetében DCC/HOBT módszert alkalmazunk a kapcsolásra. Az oldallánban alkalmazott védőcsoportok az alábbiak: Asp(Chx), Cys(pMeBzl), Glu(Bzl), Tyr(2-BrZ). Miután a szintézis befejeződött a Na-Boc védőcsoportot 50%-os diklórmetános trifluor-ecetsav segítségével távolítjuk el. A gyantát háromszor diklórmetánnal mossuk, háromszoros 10%-os díizopropil-etil-aminos diklórmetános oldattal történő mosással semlegesítjük, majd háromszor diklórmetánnal mossuk. Ezután N-acetil-imidazollal diklórmetánban acetilezzük, majd háromszor diklórmetánnal mossuk és vákuumban megszárítjuk. -A pepiidet a gyantáról lehasítjuk és egyben a védőcsoportokat eltávolítjuk. Ezt a művetetlet a víz és kis mennyiségű 30%-os vizes ecetsav alkalmazásával végezzük. Az extraktumot vízzel 2 1 térfogatra hígítjuk 5 és pH értékét ammóniumhidroxiddal 8.5 értékre állítjuk be. Ezután káliumferrícianidot adunk az oldathoz (0.01 n), amíg a sárga szín állandóvá nem válik. Az oldatot 30 percig keverjük, majd a pH értéket ecetsavval 4-5 értékre állítjuk be. Ezután az elegyet Bio- Rad AG3-X4A ioncserélő gyantával keverjük 2 órá^_ ■ 0 ig. A keveréket' leszűrjük és a szűrletet liofilizáljuk. A kapott elegyet, mely tartalmazza a cím szerinti monomert és annak dimerjét is, 92 x 2,6 cm Sephadex G-15 oszlopon 5%-os ecetsavval történő átfolyatással semlegesítjük, majd liofilizáljuk. A monomert k és dimer szétválasztását reverz fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiás (HPLC) eljárással végezzük C1* Vydac 218TP1010 (250 x 10 mm) oszlopon, 0,1% vizes trifluorecetsavban készült acetonitril eluens és 5 ml/perc sebesség alkalmazásával. A főkomponenst, mely a cím szerinti monomer, gyűjtük és liofili- 20 záljuk, és így 24 mg terméket kapunk. A később eluálódó folt a dimer, melyet szintén gyűjtünk és liofllizálunk, miáltal 14,2 g 2. példa szerinti terméket állítunk elő. A termékek homogenitását HPLC és VRK analízissel határozzuk meg. HPLC Vydac 218TP54 __ (250 x 4,6 mm) C1 * oszlop, 2 ml/perc, t = 1,8 perc! *5 elúciós idő 25-50% acetonitril tartalmazú 0,1%-os triflúorecetsav alkalmazásával lineáris gradiens mellett, amely 1%/perc (HPLC) 9,3 perc. FAB-MS(m+H) - 1414 ± 1 mikron (számított 1413). Aminosav analízis: (6n sósavas hidrolízis, 24 óra ‘időtartamig, 106 3Q °C hőmérsékleten), lásd a táblázatot. 2. példa (H-Gly-Asp-Phe-Glu-DCys-Ile-Pro-Cys-Glu-Tyr-Leu-Gln-OH)2 | | 35 f f Ugyanilyen eljárással állítjuk elő a 3. és 4. példa szerinti peptideket. 3. példa 40 H-Gly-Asp-Phe-Glu-DCys-Ile-Pro-Pen-Glu-Tyr-Leu-Gln-OH i I 4. példa (A-Gly-Asp-Phe-Glu-DCys-Ile-Pro-Pen-Glu-Tyr-Leu- 45 Gln-OH)a | | S S I I Az 1—4. példában előállított peptidek jellemzői az alábbiak. Példa Aminosav analízis (6n HC1 hidrolízis: 24 óra, 106°C) szám Asp Glu Pro Gly • llex Leu Tyr Phe 1. 1.03(1) 3.08 (3) 0.91 (1) 1.01(1) 0.72(1) 0.98(1) 0.95(1) 1.04(1) 2. ■ 1.00 (1) 3.10(3) 0.97 (1) 0.99(1) 0.91 (1) 1.01(1) 0.88(1) 0.94(1) 3. 1.00(1) 3.00 (3) 0.83 (1) 1.01(1) 0.68(1) 1.01 (1) 1.00(1) 0.99(1) 4. . 1.01 (1) 2.94 (3) 0.98(1) 1.02(1) 0.85(1) 1.02 (1) 1.02 (1) 1.01(1) x Az allo-Ile-vé átalakult részt a hidrolízis során nem mértük mennyiségileg. 4
