198512. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antikoaguláns hatású peptid és az ezt tartalmazó gyógyszerkészítmény előállítására
1 2 198.512 vegyület injektálható dózisokban oldat vagy szuszpenzió formában adagolható fiziológiásán elfogadható hígítóanyagba, gyógyszerészetileg elfogadható hordozó- 5 anyagokkal együtt, amelyek lehetnek steril folyadékok, mint például víz vagy olajok, és a formált alakban kívánt esetben más felületaktív anyagokat és más gyógyszerészetileg elfogadható adalékanyagokat is alkalmazhatunk. Alkalmazható olajok például ásványolaj, amely állati, növényi vagy szintetikus eredetű lehét, és lehet például földimogyoróolaj, szójaolaj, és ásáványi olaj. Folyékony hordozóanyagként különösen injektálható fomált alak esetében előnyösen víz fiziológiás sóoldat, dextróz oldat és hasonló cukoroldatok, etanol és glikolok, mint például propilén-gli- jg kol vagy políetilén-glikol alklamazhatók. A találmány szerinti vegyület mint tartalék injekció vagy mint beültetett készítmény adagolhatok és olyan formában készítendők, amely lehetővé teszi az aktív hatóanyag fenntartott kibocsátását. Az aktív hatóanyag labdacsokká vagy kis hengerekké préselhető 20 és szubkután vagy intramuszkulárisan beültethető, mint tartalék injekció vagy beültetett hatóanyag. A beültetett formált alakban inert anyagokat mint például biológiaitag lebontható polimereket vagy szintetikus szilikonokat, például Siiastic-ot (egy szilikon gumi, amelyet a Dow-Corning Corporation állít elő) 25 alkalmazhatunk. A találmány szerinti eljárást az alábbi példán részletesen bemutatjuk. Példa t___________ H-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-DCys-Glu-Glu-Cys-Leu- 30 -Gln-OH előállítása A pepiidet szilárd fázisú eljárással 0.1 mmól 0.66 mmó/g Boc-GIn-Pam gyanta alkalmazásával állítjuk elő. Kétszeres szimmetrikus anhidridet alkalmazó kapcsolást hatunk végre 2.0 mmól Na-Boc-aminosav ne (Peptides International) alkalmazásával, kivéve hogy a v> Boc-Gln esetében DCC/HOBT módszert alkalmazunk a kapcsolásra. Az oldalláncban alkalmazott védőcsoportok az alábbiak: Asp(Chx), Cys(pMeBzl), Glu(Bzl). Miután a szintézis befejeződött a Na-Boc védőcsoportot 50%-os diklórmetános trifluor-ecetsav segítségével távolítjuk el. A gyantát háromszor diklórmetánnal mossuk, háromszoros 10%-os diizopropil-etil-aminos diklórmetános oldattal történő mosással semlegesítjük, majd háromszor dildórmetánnal mossuk. Ezután N-acetil-imidazollal diklórmetánban acetilezzük, majd háromszor diklórmetánnal mossuk és vákuumban megszárítjuk. A peptidet a gyantáról lehasítjuk és egyben a védőcsoportokat eltávolítjuk. Ezt a műveletet vízzel végezzük, amelynek pH értékét ammóniumhidroxiddal 8.5 értékre állítjuk be. Ezután káliumferricianidot adunk az oldathoz. (0.01 n) amíg a sárga szín állandóvá nem válik. Az oldatot 30 percig keverjük, majd a pH értéket ecetsavval 4-5 értékre állítjuk be. Ezután az elegyet Bio-Rad AG3-X4A ioncserélő gyantával keverjük 2 óráig. A keveréket leszűrjük és a szűrletet liofilizáljuk. A peptidet 92x2.6 cm Sephadex G-15 oszlopon 5%-os ecetsavval történő átfolyatással sómentesítjük, majd liofilizáljuk. Ezután HPLC segítségével C1* Vydac 21BTP1010 (250x10 mm) oszlopon, 0.1% vizes trifluorecetsavban készült acetonltril-eluens és 5 ml/ perc sebesség alkalmazásával tisztítjuk. A fő komponenst gyűjtjük és liofilizáljuk és így a kívánt terméket kapjuk. A termék homogenitását HPLC és VRK analízissel határozzuk meg. HPLC Vydac 21BTP54 (250 x4.6 mm) C1 * oszlop, 2 ml/perc, t.'.ri.8 perc:eluációs idő 25 50% acetonitril tartalmú 0.1%-os trifluorecetsav alkalmazásával lineáris gradiens mellett, amely 1%/ perc. (HPLC) 5.5 perc. FAB-MS: (M»H) — 1411.7 ± I mikron (számított 1.410). Aminosav analízis: (6n sósavas hidrolízis, 24 óra időtartamig, 106 °C hőmérsékleten), lásd az 1. táblázatot, 1.58 tömeg% peptid tartalom. 1. táblázat Aminósav analízis (6n HC1, hidrolízis: 24 óra, 106°C) Hls Asx Ser Glx Pro Alá Gly Ilex Leu Tyr Plie — 1.00(1) -5.05(5) -0.95(1) 0.60(1) 1,00(1) -1.02(1) xAz allo-Ile átalakulás a hidrolízis időtartama során nert teljes. Szabadalmi igénypontok 50 1. Eljárás az (1) képletű |----------------j H-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-DCys-Glu-Glü-Cys-Leu-Gln-OH (1) peptid előállítására, azzal jellemezve , hogy a védett 1. aminosavat valamely aktivált gyanta hordozóhoz kapcsoljuk, majd a többi védett amino-savat a növekvő peptid lánc aminocsoport- 55 jához kapcsoljuk, a peptid láncról a védőcsoportokat és a gyantát eltávolítjuk, végezetül a lineáris peptidet oxidativ kapcsolási reakciónak vetjük alá. 2. Eljárás antikoaguláns hatású gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként az 1. igénypont szerinti eljárással előállított (1) képletű peptidet gyógyszerészetileg elfogadható hordozóanyaggal és kívánt esetben adalékanyaggal összekeverjük és gyógyszerkészítménnyé feldolgozzuk. rajz nélkül Kiadja: Országos Találmányi Hivatal Felelős kiadó: ifimer Zoltán o.v. KÓDEX 4
