198512. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antikoaguláns hatású peptid és az ezt tartalmazó gyógyszerkészítmény előállítására
1 2 A találmány tárgya eljárás új ciklikus peptíd előállítására, amely antikoaguláns hatással rendelkezik. Az antikoaguláns szerek alkalmas terápiás hatóanyagok, például akut mélyvénás trombózis, tüdőembólia, akut artériás embólia, szívizom infarktus és elszórt éren belüli koaguláció gyógyszerészeti kezelésére. Az antikoaguláns szerek megelőző alkalmazása lehetővé teszi a reumatikus vagy ételmeszesedéses szívbetegségekben szenvedő betegek esetében az embólia visszatérésnek megakadályozását és megakadályozza sebészeti beavatkozások során bizonyos thrombus-embóHa kialakulását. Antikoagulánsok adagolása történik szívkoszorú verőér és agyérrendszeri betegségben szenvedők kezelése esetében is. Az artériás trombózis, különösen a szívizmot és az agyat ellátó artériák esetében az elhalozás egyik fő oka. A hirudin egy 65 egységből álló polipeptid, amelyet pióca nyálmirigyébol izoláltak. Ez egy olyan antikoaguláns, amely thrombin specifikus inhibitor hatással rendelkezik. A hirudin ugyan igen-jó hatékonyságú, de a pióca nyálmirigyéből izolált anyag klinikai alkalmazása mennyiségénél fogva limitált. Ezen túlmenően az Izolált anyag drága és alkalmazását, mint minden ilyen méretű fehérje adagolását allergiás reakciók követik. A szerzők felfedezték, hogy a hirudin egy specifikus részlete felelős, legalább részben antikoaguláns hatásáért. A részlet molekulát kémiai úton előállítottuk és ennek bizonyos ciklusos analógjairól kitűnt, hogy a thrombin felismerési helyére kötődnek, de nem kötődnek az ettől térben elkülönülő thromín enzimatikus hasítási helyére. A szintetikus peptidek kötődése tökéletesen meggátolja a fibrinogén megkötődését a thrombin felismerési helyekre, ami előfeltétele a fibrin keletkezésének és a vérrög képződésének. A találmány szerinti eljárással előállított peptidek jelentős antikoaguláns aktivitással rendelkeznek és az a szokatlan jellemzőjük, hogy csak a thrombin felismerési helyhez kötődnek és nem kötődnek a thrombin enzimatikus hasítási helyéhez, lehetővé teszi egy tudományosan érdekes és terápiásán jelentősantikoaguláns gyógyítási eljárás megvalósítását. A találmány tárgya eljárás új. (1) képjetfi, H-Glu-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-DCys^GiiT-Giu-Cys-Leu-Gln-OH (1) pepiidnek szilárd fázisú szekvenciális vagy blokk szintézis eljárással történő előállítására. A találmány szerinti eljárással előállított fenti vegyidet antikoaguláns hatással rendelkezik. A találmány szerinti eljárás leírásában az aminosavak rövidítésére az alábbi jelöléseket használjuk: Leu leucin Ile - Izoleucin Phe - fenil-alanln Glx - gluatminsav- vagy glutamin Cys — cisztein Gin — glutamin Asp aszparginsav Glu — glutaminsav DCys - D-cisztein. A fent említettek közül természetesen előforduló amlnosavak a leucin, az izoleucin, a fenil-alanin, a cisztein, a glutaminsav és a glutamin, lipofil aminosavak pedig a Phe, Leu és He mainosavak. A természetesen-előforduló aminosavak a gllcin kivételével királis szénatomot tartalmaznak. Hacsak másképp nem jelezzük, a megadott optikailag aktív aminosavak alatt ezek Lkonfigurációját értjük. Mint a szakirodalomban ez szokásosan alkalmazott, a peptid szerkezetét úgy írtuk fel, hogy az amino terminális egység a lánc baloldalán és a karbocil terminális egység a jobb oldalán található. A találmány szerinti eljárás során az (I) képletű pepiidet szilárd fázisú szekvenciális szintézissel állítjuk elő. A szilárd fázis szekvenciális eljárást automata peptid szintetizátor alkalmazásával hajthatjuk végre. Ebben az esetben az a-aminocsoporton védett aminosavat kötjük a gyanta hordozóhoz. Az alkalmazott gyanta hordozó lehet bármely polipeptid szilárd fázisú előállításban szokásosan alkalmazott gyanta, és előnyösen polisztirol, amely körülbelül 0.5-3% divinil-benzol keresztkötéseket tartalmaz, és amely vagy klórmetilezett vagy hidroximetilezett, amely funkciós csoportok alkalmasak a kezdetben bevezetett a-amlnocsoporton védett aminosawal való észterkötés létrehozására. Egy hidroxil-metil-gyantát írt le Bodanszky és csoportja Chem.Ind. (London), 38, 1597-98 (1966.) közleményében. Egy klór metilezett gyanta kereskedelemben kapható, a Bio Rád Laboratories, Richmond, California terméke. A klór- metilezett gyanta előállítási eljárást közölték Stewart és mtsai. Solid Phase Peptide Synthesis (Freeman and Co., San Francisco 1969.), Chapter l.pp.1-6 közleményükben. A védett aminosavat a gyantához Gisin, Hevl.Chim.Acta, 56, 1476 (1973) közleményében leírt eljárása szerint kapcsolhatjuk. Számos gyantához kötött védett aminosav kereskedelemben kapható. Miután az a-amlnocsoporton védett aminosavat a gyanta hordozóhoz kötöttük, alkalmas eljárással, például diklórmetánban trifluor-ecetsavat alkalmazva, tiszta trifluor-ecetsavat alkalmazva, vagy dioxános sósavat alkalmazva, a védőcsoportot eltávolítjuk. A védőcsoport eltávolítását körülbelül 0 °C-szobahőmérséklet közötti hőmérsékleten végezzük. Más sepciális a-aminosav védőcsoport eltávolításra alkalmas standard hasítási eljárások is alkalmazhatók. Miután a-aminocsoport védőcsoportot eltávolítottuk. a többi, aminocsoporton védett aminosav a kívánt sorrendben kapcsolható a molekulához. Más eljárás szerint több aminosavból álló fragmenseket állítunk elő oldatban kapcsolási eljárással, és ezt kapcsoljuk a gyantához kötött aminosav szekvenciához. A polipeptid szekvenciába bevezetett egyes a-aminocsoporton védett aminosavak esetében az alkalmazott aminocsoport védőcsoport bármely ilyen, a szakirodalomban ismert védőcsoport lehet. Az alkalmazható a-aminocsoport védőcsoportok az elábbiak lehetnek: (1) acil típusú védőcsoportok, mint például formilcsoport, trifluor-acetil-csoport, ftalil-csoport, toluol-szulfonil-csoport (tozilcsoport), benzilszulfonil-csoport, nltro-fenil-szulfenil-csoport, tritilszulfenil-csoport, o-nitro-fenoxi-acetil-csoport, és a-klór-butil-csoport, (2) aromás uretán típusú védőcsoportok, mint például benziloxi-karbonil-csoport, szubsztituált benzifoxi-karbonil-csoportok, mint például p-klór-benziloxi-kaibonil-csoport, p-nitro-benziloxi-karboníl-csoport, p-bróm-benziloxi-karbonil-csoport, p-métoxi-benzil-oxi-karbonll-csoport, l-(p-bifenll)-l -metil-etoxi-karbonil-csoport, a a-dimetil-3,5-dimetoxi-benziloxi-karbonil-csoport, és benzhidriloxi-karbonil-cso-198.51 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
