198393. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hatóanyagként pirimidin-nukleozid származékokat tartalmazó, hepatitisz kezelésére alkalmas gyógyszerkészítmények előállítására
1 198 393 2 A találmány tárgya eljárás hatóanyagként ismert pirimidin-nukleozid-származékokat tartalmazó, új gyógyászati hatású gyógyszerkészítmények előállítására, hepatitisz kezelésére. A hepatitisz B virion (HBV) — amely mint Dane-részecske is ismert - 42 nm-es, komplex, göm alakú részecske, amely egy külső lipoprotein-burokból.(Hepatitis B felületi antigén, HBsAg) és egy belső magból (Hepatitis B mag antigén, HBcAg) áll. A fenti mag egy cirkuláris, részben kettős szálú DNS-t (dezoxiribonukleinsavat) és egy DNS-polimerázt tartalmaz, az NDS-polimeráz in vitro kitölti a genomban lévő nagy, egyes szálú régiót, amelyből a genómba teljes egészében kettős szálú DNS replikálódik. A Dane-részecskékben lévő DNS-poIimeráz természete még nem teljesen világos. Ismeretes, hogy a HBV DNS- polimerázt äz interkaláló szerek, pirofoszfát-analógok és arabino-furanozil-nukleotidok szelektíven gátolják, ami lehetőséget nyújt a Hepatitis B vírus replikációjának gátlására, krónikus hepatitisz B-ben szenvedő betegek esetén. Tapasztalataink szerint a HBV DNS-plimeráz az (I) általános képletű 5-szubsztituált-l-(2’-dezoxi-2’-szubsztituált/3-Darabino-furanozil)-származékokkal is gátolható. Az (I) általános képletben A jelentése aminocsoport vagy hidroxilcsoport, X jelentése halogénatom Y jelentése halogénatom vagy 1—4 szénatomos alkilport. A fenti vegyületek a 4 211 773 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásból (Lopez és munkatársai) mint herpeszvírus elleni szerek ismertek. A 4 211 773 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás példáiban az (I) általános képletű vegyületek közül az alábbiakat állították elő: Példa száma A X Y Olvadáspont CC) 4. NHj fluor bróm 201-202 5. OH fluor metil 185-185,5 6. OH fluor bróm 214-216 7. OH fluor jód 216-217 8. NH2 fluor jód 177-181 Azt az (I) általános képletű vegyületet, amelynek képletében A jelentése hidroxilcsoport, X jelentése fluoratom, és Y jelentése etilcsoport, Watanabe és munkatársai [J. Med. Chem. 27, 91 (1984)] állították elő. Tekintettel arra, hogy általános vírusellenes szer, amely mindenfajta vírus ellen hatásos jelenlegi tudásunk szerint - nem ismeretes, a herpeszvírus elleni hatásból még szakember számára sem volt kézenfekvő, hogy ezek a vegyületek a hepatitisz B virion ellen is hatásosak. A HBV-hez hasonló anyagot találtak az amerikai mormotában (woodchuch), ez az úgynevezett woodchuch hepatitisz vírus (WHV). Mindkét anyag a vírusok ugyanazon új osztályába tartozik, ezeket Hepa-DNS-vírusoknak is szokás nevezni. Ismeretes, hogy a HBV és WHV DNS-polimeráz alapvető tulajdonságai megegyeznek. Ezért az alább ismertetett in vitro kísérleteink során a WHV DNS-polimeráz aktivitását a HBV DNS-polimeráz aktivitásával párhuzamosan tanulmányoztuk. A találmány szerinti eljárással előállított gyógyszerkészítmények a humán gyógyászatban Hepatitis B virion fertőzések kezelésére, az állatgyógyászatban a mormoták vVHV fertőzésének kezelésére használhatók. A fenti gyógyszerkészítmények hatóanyagként ismert módon előállított (I) általános képletű 5-szubsztituált-l-(2’-dezoxi-2,-szub^ztituált- 0-D-arabino-furanozil) -pirimidin -nukleozid -származékokat — a képletben A, X és Y jelentése a fenti — tartalmaznak, a gyógyszerkészítésben szokásosan használt hordozó- és/vagy egyéb segédanyagok mellett. Az „ismert módon előállított” kifejezés a jelen találmány elsőbbségi napja előtt publikált eljárásokat öleli fel. A gyógyszerkészítményeket a gyógyszerkészítésben szokásos eljárásokkal állítjuk elő, oly módon, hogy a hatóanyagot a hordozóés/vagy egyéb segédanyagokkal összekeverjük, majd gyógyászati készítménnyé formáljuk. A gyógyszer hatóanyagát képező pirimidin-nukleozidszármazékok hepatitisz-ellenes hatásának vizsgálatát az alábbiak szerint végezzük. A DNS-polimeráz aktivitással rendelkező HBV-részecskéket egy HBsAg-re pozitív immunszuppresszált beteg szérumának tisztításával nyerjük. A WHV-t öt, a vírust krónikusan hordozó mormota (Marmota monax) szérumából állítjuk elő. Az eredetileg Pennsylvania államból származó mormoták (Dutchland Láb. Pennsylvania, Amerikai Egyesült Államok) egy már több, mint egy éve szerológiai vizsgálatokkal követett kolóniához tartoznak [Hantz és munkatársai, J. Virol. Meth. 7, 45-55 (1983)] A vírust szacharózon és izopiknikus cézium-klorid gradiensen centrifugálással tisztítjuk (Hantz és munkatársai, közlés alatt lévő anyag). A leírásban használt rövidítések jelentése az alábbi: dTTP dezoxitimidin-5’-trifoszfát, dATP dezoxiadenozin-5’-trifoszfát, dCTP dezoxicitidin-5’-trifoszfát, dGTP dezoxiguanozin-5 ’-trifoszfát, LAMP dezoxiadenozin-5’-foszfát, dTMP dezoxitimidin-5’-foszfát, FIAC l-(2’-dezoxi-2’-fluor-/J-D-arabino-furanozil)-5-jód-citozin, PIAU l-(2’-dezoxi-2’-fluor-i3-D-arabino-furanozil)-5-jód-uracil, FMAU l-(2’-dezoxi-2’fluor73-D-arabino-furanozil)-5-metil-uracil, FEAU l-(2’dezoxi-2’-fluor-0-D-arabino-furanozil)-5-etil-uracil, FIACTP l-(2’-dezoxi-2’-fluor-/3-D-arabino-furanozil)-5-jód-citozin-5’trifoszfát, FMAUTP l-(2’-dezoxi-2’-fluor-ß-D-arabino-furanozil)-5-metil-uracil-5’-trifoszfát, ACV 9-(2-hidroxi-etoxi-metil)guanin (aciklovir), ACVTP 9-(2-hidroxi-etoxi-metil)-guanin-trifoszfát, ara-AMP 9-(0-D-arabino-furanozil)-adenin-5’-foszfát, ara-TTP l-((3-D-arabino-furanozil)-timin-5’-trifoszfát, ara-CTP 1 -(ß-D-arabino-furanozil)-citozin- 5 ’-trifosz fá t, BVdU (E)-5-(2-bróm-vinil)-2’-dezoxi-uridin, BVdUTP (E)-5-(2-bróm-vinil)-2’-dezoxi-uridin-5’-trifoszfát, DHPG 6-( 1,3 -dihidroxi-2-propoxi-metil)-guanin. Az in vitro vizsgálatokat trifoszfátokkal végezzük. Ez 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
