198103. lajstromszámú szabadalom • Enzimes eljárás 3-helyettesített cephalosporinok előállítására
15 198 103 16 Red A, Ainicoii Corp., Mass., USA). Előzetes kísérletek szerint a Procion Red (0,1 mmól) teljesen gátolja az expandáz aktivitást. Az oszlopot 350 ml extraháló pufferrel mossuk 24 ml/óra sebességnél és az enzimet 0-1,5 mól lineáris gradiensű KCl-el eluáljuk, 500 ml felett, ugyanilyen folyási sebességnél. A/, aktív frakciókat egyesítjük és 8 ml/perc folyási sebességgel egy Mono Q 16/10 erős anioncserélő oszlopra viszszük FPLC-re (Pharmacia Ltd.). Az enzimet 80- 400 mM lineáris gradiensű NaCl-el eluáljuk Trisz/HCl (20 mM), 8,0 pH-jú pufferben, amely 2 mM DTT-t tartalmaz, ugyanolyan folyási sebességnél. Az aktív frakciókat egyesítjük és betöményítjük, majd 0,25 ml/perc folyási sebességgel egy Superose 12 FOLC gélszűrő oszlopra visszük. Az enzimet 0,1 mólos, 8,0 pH-jú Trisz/HCl-el eluáljuk, amely 2 mM DTT-t tartalmaz. Az aktív frakciókat egyesítjük és a konverziós kísérleteknél használjuk fel azokat. Példák Általános módszer expandáz anyag iukubálására. Az expandázt tisztítás után 50 mmólos, 7,4 pH-jú Trisz/HCl pufferrel készült szuszpenziókat kapjuk (körülbelül 0,5-1 LU. (ml). A következő módszert használjuk 0,2 mg anyag inkubálásához. 0,42 mg (1,5X10“3 mmól) ferro-szulfát és 4,3 mg (2,4X 10-3 mmól) L-aszkorbinsav 3 ml vízzel készített oldatához hozzáadunk 5,3 mg a-keto-glutarátot. Az elegy pH-ját ezután 7,6-ra állítjuk be 100 mmólos vizes nátrium-hidroxid-oldattal. A kapott oldatot (0,25 mól) hozzáadjuk az expandáz enzim 1,65 ml 50 mmólos Trisz/HCl-lel készített oldatához (körülbelül 11.U.) és az elegyet előinkubáljuk 270 ford/percnél 27 °C-on 5 percig. Az anyagot 0,1 ml vízben ezután hozzáadjuk az elegyhez és 2 óra hosszat inkubáljuk. A proteint elkülönítjük és ezt követően feldolgozzuk ugyanolyan módon, mint az inkubálásra használt IPNS enzim esetén. 1. példa 7/?-(5-karboxi-pentán-amido)-3-metil-3-cefem-4-karbonsav 13. előállításmód szerint kapott 6/J-(5-karboxi-pentán-amido)-2,2-dimetil-penam-3-karbonsavat inkubálunk expandázzal a fent leírt általános módszer szerint. A vegyületet ezután a nyers inkubációs elegyből HPLC-vel elkülönítjük. ‘H-NMR (DjO, 500 MHz): 5 1,46-1,53 (4H, m, CH2CH2CH2CÜ2), 1,79 (3H, s, Me), 2,09-2,10,2,22- 2,30 (4H, 2Xm, CH2CO), 3,12, 3,47 (2H, ABq, J = 13, 4-H), 5,96, 5,44 (2H, ABq, J=4,5, 6-H, 7—H). Tisztítás: A HPLC-t részleteiben a 13. előállításmódnál ismertetett módon végezzük azzal az eltéréssel, hogy a tartózkodási időt 6,8 percre növeljük. A termékei a következő módon alakítjuk át: a HPLC-ből kapott tennék egy mintáját feloldjuk 2 ml 2 normál HCl-oldatban és 2X10 ml etil-acetáttal extraháljuk. A szerves réteget körülbelül 5 ml-re betöményitjük. Ezután diazometánt adunk feleslegben étcrcs oldat alakjában keverés közben az olduthoz, majd 10 perces keverés után az oldatot szárazra pároljuk és így a nyers diésztert kapjuk. ‘H-NMR (500 MHz, CHCla): ő 1,43-1,71 (4H, m, CH2C//2C//2CHí), 1,70 (3H, s, CMe), 2,29-2,35 (4H, m, 2XCH2CO), 3,24, 3,50 (2H, ABq, J=18 Hz, 4-H), 3,68, 3,85 (6H, 2Xs, 2XOMe), 4,98 (1H, d, J =4,5 Hz, 6-H), 5,79 (1H, dd, J=4,5 Hz, 8,5,7-H), 6,18 (Ili, d, J=8,5 Hz, NH). m/e (NH3, deszorpciós kémiai ionizáció): 388 (32, M+NH4), 371 (34, M++1). 2. példa 7^-(3-karboxi-fenil-acetil-amino)-3-metil-3-cefcm-4-karbonsav 6/?-(3-karboxi-fenii-acctil-amino)-2,2-dimetil-pcnam-3-karbonsavat expandázzal együtt inkubáluuk az. általános módszer szerint. A vegyületet HPLC-vel kinyerjük a Jiyers inkubációs elegyből: (6R,7R)-l-aza-3-metil-7-(m-karboxi-fenil-acetil)-8-oxo-5-tiabiciklo[4.2.0]okt-2-én-karbonsav. ‘H-NMR (500 MHz, D20): 8 1,77 (3H, 2, CH3), 3,06, 3,37 (2H, ABq, J= 18 Hz, SCH2), 3,57, 3,63 (2H, ABq, J= 15 Hz, CH2Ar), 4,89 és 5,39 (2H, 2Xd, J =4,5 Hz, 6-H, 7-H), 7,31-7,43 (2H, m, Ar-H), 7,74-7,77 (2H, m, ht-H). m/e (erős atombombázás). 399 (M+ + Na). Tisztítás: HPLC részletek egyeznek a 13. előállításmódnál leírtakkal azzal az eltéréssel, hogy a mozgó fázis: 2% CH3CN/98% 10 mmólos NHJICOj. Tartózkodási idő: 8,5 perc. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Enzimes eljárás (I) általános képletű 3-helyettcsített cefalosporinok előállítására, e képletben R 3-karboxi-fenil-acetil- vagy adipoilcsoport, és Rí valamely 1-3 szénatomos alkilcsoport, azzal jellemezve, hogy vizes közegben 20 °C és 40 °C közötti hőmérsékleten, valamint 6 és 9 közötti pll-n valamely (II) általános képletű 2fJ-inetil-2a-helyettesített penam-3-karbonsavat, e képletben R és Rj jelentése a fenti, a dezacetoxi-ccfalosporin C szinteáz enzimmel hozunk érintkezésbe oxigén, ferroion, aszkorbát és a-ketoglutarát jelenlétében. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 9
