198103. lajstromszámú szabadalom • Enzimes eljárás 3-helyettesített cephalosporinok előállítására
7 198 103 8 D. S-(4-metpxi-bcnzil)-L-cisztcinil-D-vann-difciiilmctil-észter aeilezésc 427 mg (1,58 mmól) 4-(benziloxi-karbonU)-fenilecetsav, 390 mg (1 egyenértéknyi) EEDQ és 1 egyenértéknyi S-(4-metoxi-benzil)-L-cisztcinil-D-valin-difenil-metilészter 10 ml száraz metilén-kloriddal készített elegyét szobahőmérsékleten keverjük éjszakán át. Az oldószert lepároljuk és a maradékot 80 ml etilacetátban oldjuk. Az oldatot vizes nátriumhidrogén- : karbonát-oldattal, telített konyhasó-oldattal, 10%-os vizes citromsav-oldattal, ismét telített konyhasó-oldat- \ tál mossuk és nátrium-szulfát felett szárítjuk. Az oldószert lepároljuk és a maradékot kromatográfiásan tisztítjuk, az eluálást 20%-os etil-acetát/petrolétcr-elegygyel végezzük. Ily módon 1,005 g N-(3-(benzoloxikarbonil)-fenil-acetil] -S 4- (metoxi-benzil)-L-ciszteinil- D-valin-difenil-metilészter kapunk. Op.: 136 9C és 137 °C között van (dietil-éter). Analízis C^H^N^S képletre számított: C 71,22; H6,U; N3,69%; talált: C 71,12; H6.02: N3,59%. ‘H-NMR (CDCI3, 300 MHz): 8 0,73 és 0,85 (minegyik 3H, d, J=6,9 Hz), 2,23 (1H, m), 2,62 (1H dd, J=14,0,7,5 Hz), 2,82 (1H, dd, J= 14,0, 5.4 Hz), 3,56 (2H, s), 3,69 (2H, s). 3,76 (3H, s). 4,52 (1H, dd, J=7,5, 5,4 Hz), 4,63 (1H, dd, J-8,5, 4,4 Hz), 5,35 (2H, s), 6,35 (1H, d, J=7,5 Hz), 6,70 (lH, d, J=8,5 Hz), 6,83 és 7,16 (mindegyik 2H, d, J=8,0 Hz), .6,91 (1H, s), 7,28 ~ 7,48 (17H, m), 7,96 (2H m). IR (CHCI3): 3400, 3010,2960,1720,1670,1610, 1515, 1500 cm-1. MS: 758 (M+). 150 mg fenti, háromszorosan védett N-acilezési terméket (0,2 mmól) feloldunk 3 ml metilén-kloridban, és 0,36 ml anizolt adunk az oldathoz. Az oldatot jeges fürdőben hűtjük és 2 ml 0,5 mólos nitrometános alumínium-koridos oldatot adunk hozzá. Az elegyet 2 óra hosszat 0 °C-on, és utána 3 óra hosszat szobahőmérsékleten keverjük. Ezután a rcakcióelegyet etil-acetáttal hígítjuk, 1 normál hidrogénklorid-oldattal mossuk és 5 %-os vizes nátrium-hidrogénkarbonát-oldattal extraháljuk. A kivonatot etilacetáttal mossuk, hidrogénklorid-oldattal megsavanyítjuk és a védőcsoportoktól megszabadított pepiidet etil-acetáttal extraháljuk. A kivonatot telített konyhasó-oldattal mossuk és bepároljuk, így 70 mg cím szerinti vegyül etet kapunk 93 %-os kitermeléssel. Op.: 196-197 °C (bomlik), (acetonból)! Analízis Ci7Hi2N206S képletre számított: C 53,39; H 5,80; N7,32%; talált: C 53,55; H5.82; N7,23%. ‘H-NMR (300 MHz, CD3OD): 8 0,89 és 0,94 (mindegyik 3H, d, J=6,9 Hz), 2,15 (1H, m), 2,81 és 2,90 (mindegyik 1H, dd, J=14,0, 6,5 Hz), 3,67 (2H, s), 4,31 (1H, d, J=5,4 Hz), 4,58 (1H, t, J=6,5 Hz), 7,42 (1H, t, J=7,7 Hz), 7,56 (1H, d, J=7,7 Hz), 7,90(111, d,J=7,7 Hz), 8,01 (1H, s). MS (FAB EX. glicerin/oxálsav) rn/e: 383 (M + l). IR (KBr): 3300, 2800~ 3300 (széles, 2680 (w), 2560 (w), 1730,1700,1650,1605 cm'1, 2. clődllitámnód 6/J-(3-karboxi-fenil-acetil-amino)-2,2-dimetilpenam-3-karbonsav IPNS-el 1,4 mg (3,66X 10-3 mmói N-(3-karboxi-fenil-acctil- ' L-ciszteinil-D-valin, 100jul lOOmmólos ditiotreit, 10ju 5 mmólos ferro-szulfát, 100ju SOmmólos L-aszkorbinsav, 50 p kataláz (1/10-es hígítás), 1 ml 50 mmólos ammónium-hidrogénkarbonát és 3,5 ml izopenicillin N-szintetáz 50 mmólos ammónium-hidrogénkarbonáttal készült oldata [amelyet 1 ml IPNS Trisz • HC1- pufferrel készített oldatából állítottunk elő (aktivitás 2700 C.U. ml-1, fajlagos aktivitás 109,8 C.U. ml-1)] elegyét két egyenlő térfogatra osztjuk és mindkét felet egy-egy fiolába tesszük. A két fiola tartalmát 30 °C-on inkubáljuk (szabad levegőzés) 250 ford/perc sebességnél. Mindegyik fiolába 50 p 100 mmólos ditioreitet és 50 ju 5 mmólos ferro-szulfátot adunk 30 perc múlva, és az inkubálást 30 percig folytatjuk. Az inkubált elegyeket egyesítjük, 12 ml acetont adunk hozzá, és az elegyet centrifugáljuk. A felüiúszót dekantáljuk és szárazra pároljuk, a maradékot pedig fagyasztva szárítjuk. A terméket fordított fázis útján Cig analitikai oszlopon tisztítjuk 3% acetonitril 90% 10 mmólos ammónium-hidrogénkarbonát felhasználásával. ‘H-NMR (300 MHz, D20): 8 1,30 (311, s), 1,38 (3H, s), 3,55 és 3,63 (mindegyik 1H, d, J=15,0Hz), 4,07 (1H, s), 5,25 és 5,35 (mindegyik 1H, d, J=3,8 Hz), 7,35 (2H, m), 7,71 (2H, m). A terméket NMR-el vizsgáljuk nátrium-trimetilszilil-propionát-d4-el (1,83 X10—4 mmól) a (3-laktám meghatározására. A 60-(3-karboxi-fenil-acetil-amino)penicillánsav tennéket 68 %-os kitermeléssel kapjuk. 3. előállitásmód Adipoil-(L)-cis/.tciuil-(L))- valin 1) Adipinsav-mono-benzil-észter 2,92 g (20,0 mmól) adipinsavat feloldunk 25 ml dimetil-fonnamidban, és az oldatot 70 °C-ra melegítjük, majd hozzáadunk 4 ml diciklohcxil-amint. Az elegyet 70 °C-on keverjük 15 percig, utána hozzáadunk 3,42 g (20,0 mmól) benzil-bromidot, és a keletkező szuszpenziót további 20 percig keverjük 70 °C-on, majd 20 °C-ra hűtjük. Ezt követően 100 ml etil-acetátot adunk az elegyhez, és a szuszpenziót szűrjük, a szűrletet 3X200 ml vízzel mossuk, és a vizes réteget 11 pH-ra lúgosítjuk vizes nátrium-hidrogénkarbonát-oldattal. A vizes réteget elkülönítjük, 2X100 ml etil-acetáttal mossuk, 2 normál HCl-oldattal 2 pH-ra savanyítjuk és újra extraháljuk 2X100 ml etil-acetáttal. A szerves kivonatokat egyesítjük, 3X100 ml vízzel mossuk, Na2S04 felett szárítjuk, szűrjük és szárazra pároljuk. A maradékot kromatografáljuk szilikagél és etil-acctát felhasználásával, ily módon a címben megadott vegyülőtet kapjuk 890 mg mennyiségben. Kitermelés: 19%. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
