198085. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új, véralvadásgátló hatású hirudinszármazékok és az ezeket hatóanyagként tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
3 J98 085 4 centrációja 50%-ig terjedhet. Enné) a megoldásnál számos nem kívánatos fehérje oldatban marad. Ezt a kicsapást is hűtés közben végezzük; a kicsapás hőmérséklete —5 és 15 °C, előnyösen 0 és 4 °C között lehet. Az így kapott anyag még mindig két polipcptid elegyéből áll. A találmány szerinti (II) általános képletű polipeptidet — a képletben R jelentése hidrogénatom vagy S03H csoport — előnyösen oly módon állítjuk elő, hogy a kapott nyers-extraktumot NH4HC03 vizes oldatában feloldjuk és több, nagyfelbontó képességű kromatográfiás rendszeren frakcionáljuk. A kapott frakciót egy további nagyfclbontó képességű rendszeren engedjük át, és az egyes komponenseket elkülönítve megkapjuk a (II) általános képletű polipeptidet. A liirudin származékok előállításának első lépésénél előnyösen az A 82359 szánni közzétett európai szabadalmi bejelentésben leírt kromatográfiás eljárást használhatjuk. Ennél a lépésnél a fehérje elegyet hagyományos kovasavgélen vagy kovasav-géllel előre töltött oszlopon (például LobarR-oszloppal) bontjuk szét komponenseire. Eluálószerként puffer-rendszert használunk. A vizsgálati anyagot előoszlopra visszük fel, amelynek egyensúlyát előre beállítottuk. A vizsgálati anyagot azonban felvihetjük száraz oszlopra is. A vizsgálati anyag és az adszorbens aránya előnyösen 1 :50—1 :200 között van. Az eluáláshoz metanolból, jégecetből és trietiiaminból áltó puffert használunk. De alkalmazhatunk más puffert is; így például 70% etanolból és 30% trisz-pufferből (0,05 mól, pH = 8,0) álló elegyet. Utolsó tisztítási lépésként kromatográfiai végzünk reverz-fázisú rendszeren. A nagy feloldóképességű HPLC eljárással [L. High Performance Liquid Chromatography Advances and Perspectives, 3. kötet, Horváth Cs.: Academic Press, 50—83. oldal (1983); vagy Methods of Enzymology, 91. kötet, 137—190 és 352—359. oldal (1983)] megszabadíthatjuk a (II) általános képletű polipeptideket a nem kívánatos kísérőanyagoktól (fehérjék) és tiszta állapotban különíthetjük el őket. Álló fázisként előnyösen megfelelő szemcseméretű kovasav-származékokat használhatunk; (szemcseméret 3 és 20 pm között). Kovasav-származékként használhatunk oktadecil-szilán-származékot, de egyéb szilánszármazékok is számításba jöhetnek, így rövidszénláncú alkil-, fenil-alkil-, vagy aminocsoporttal szubsztituált alkilcsoportot tartalmazó sziláitok; ez utóbbit az ioncserélő és reverz-fázisú kromatográfiánál használják. Az oszlopok hosszúsága előnyösen 5—25 cm, átmérőjük előnyösen 3—11 mm. Eluálószerként vizes, szerves oldószeres pufferelegyeket használhatunk, így például rövid szénláncú alkoholokat, ketonokat, nitrileket, étereket, savakat, aminokat, glikol-étcreket, amidokat vagy ennek származékait használhatjuk. Pufferanyágként számításba jöhetnek szervetlen vagy szerves sók vagy egyéb adalékanyagok. Az eluálást előnyösen 2 és 8 pH között végezzük. Amennyiben könnyen illő pufferanyagot használunk, így ammóniuni-acetátot, vagy ammóniumhidrogen-karbonátot, az eluátum fagyasztásos-szárításával a hirudinszármazék egyszerű módon kinyerhető. A (II) általános képletű polipeptid színtelen anyag, vízben és vizes puffer-oldatban jól oldódik, a poliakrilamid-elektroforézis során homogén anyagként viselkedik; izoclektromos pontja 3,9 (a meghatározást izoelektromos fókuszálással végezzük). A polipeptid aminosav összetételének meghatározását Moore és Stein módszerével [Methods of Enzymology IV. kötet, 819-831. oldal, Rolovick és Kaplan, Academic Press, New York, London (1963)] végezzük. A meghatározás eredményeként az alábbi aminosavakat kapjuk: 9 aszparaginsav, 5 treonin, 4 szerin, 13 glutaminsav, 3 prolin, 9 glicin, 2 valin, 6 cisztein, 2 izoleucin, 4 leucin, 2 tirozin, 1 fenil-alanin, 3 lizin és 1 hisztidin. Az (I) általános képletű termékeket, valamint ezek fiziológiailag elfogadható savaddíciós sóit — a képletben R jelentése hidrogénatom vagy S03H X jelentése Ile, Leu Y jelentése Thr és m értéke 0 vagy 1 — amikoris a 6 Cys-csoport közül kettő az 5, 13, 15,21, 27 és 38 helyen diszúlfid hídon keresztül kapcsolódik — a következő eljárás változatokkal kapjuk meg: a) az (I) általános képletű polípeptidek — amelyek képletében X jelentése Ile, Y jelentése Thr és R jelentése 11 vagy SOjll és m értéke 0 vagy 1 — előállítására a Hirudo medicinalis férgek első feléből 0,01-5 tömeg %-os NaCl oldattal extraháljuk, holuselinnel a proteslifikus enzimet eltávolítjuk, a kapott fehérje oldatot (NH^SCU telített oldatával kicsapjuk és a csapadékot NH4HC03 vizes oldatban feloldjuk, ezt követően 500 000 Dalion kapillármembránnal és 10 000 Dalton síkmembránnal szűrjük, fagyasztva szárítjuk, szilikagélen kromatografálássa] előtisztítjuk, az eluátumot szilikagélszármazékon, előnyösen oktadecilszilán-származekon túlnyomásos oszlopkromntográfiával tisztítjuk, és az így kapott polipeptidet kívánt esetben fiziológiailag elfogadható savaddíciós sóvá alakítjuk, vagy b) az (I) általános képletű polipeptideket — amelyek képletében Y jelentőse Thr, R jelentése H, vagy -S03H, m értéke 0 —, előállítására a (III) képletű Val'-Val2-Tyr3-Thr4- Asp5-Cys6 -aminoterminális hirudin-származékot piridin/víz pufferben izocianáttal, előnyösen fenilizotiocianáttal reagáltatjuk, és az első aminosavat lehasítjuk, majd a reakciót megismételjük, és az így kapott pepiidet egy U-(X),„—Y 011 általános képletű pepiid reakcióképes származékával, így aktív észterével reagáltatjuk — a képletben m, X és Y jelentése a (I) általános képletben megadott. U jelentése peptidkémiában ismert uretán védőcsoport, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
