198075. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új vinblasztin konjugátumok és származékaik, valamint ezeket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
5 198 075 6 klórhangyasav-alkilészter, előnyösen klórhangyasavetil- vagy izobutilészter segítségével amin-bázis, így trictil-amin, N-mctil-pipcridin vagy N-metil-morfolin jelenlétében szerves oldószerben, így etii-acetátban, tetrahidrofuránban vagy metilén-kloridban. A kapott származékot izoláljuk a reakcióelegyből és a kémiában szokásos módszerekkel tisztítjuk. A vinka-alkaloiddal történő kondenzációhoz az (A) általános képlctű vcgyüict karboxil-csoportja bármely más módszerrel, például a peptid-kánűáhan alkalmazott módszerekkel is aktiválható. A konjugátum előállítása során eljárhatunk úgy is, hogy a fehérjét, a poliklón vagy monoklón antitestet a (III) általános képletű vinka vegyülettel szokásos körülmények között, például vizes közegben 4—40 °C közötti hőmérsékleten és pH =7,5—9,5 értéken reagáltatok. A rögzített csoportok száma a reagens koncentrációjától és a reakcióidőtől függ, de az átlagos szám általában 5—20 között van. Az eljárás megvalósítása során eljárhatunk úgy, hogy a (III) általános képletű vegyület szerves oldószerben, így dioxánban felvett oldatát a feliérje pufférolt, például 0,1 mól/liter foszfátpufferral pH = 8,2 értékre beállított oldatához csepegtetjük. Az elegyet egy éjszakán keresztül szobahőmérsékleten állni hagyjuk, majd a konjugátumot gélszűréssel izoláljuk, ultraszűréssel koncentráljuk és sterilizáljuk. A fehérjetartalmat Lowry módszerével mérjük, míg az alkaloidtartalmat a radioaktivitás mérésével határozzuk meg. A konjugátumok in vitro és in vivo vizsgálatával megállapítottuk, hogy az (A) általános képletű vegyüleíből származó (a) vagy (b) általános képletű oldalláncot tartalmazó konjugátumok lényegesen előnyösebb tumor elleni hatást mutatnak, mint az —0—CO—X—CO- láncot tartalmazó konjugátumok. Az oldallánc lehetővé teszi, hogy a fehérjét, vagy fehérjefragmenst mind a szabad aminocsoportoken, mind a szabad tiolcsoportokon keresztül megkössük. Emellett, lizozomá! enzimmel végzett emésztés azt mutatja, hogy a vinka alkaloid sokkal nagyobb arányban szabadul fel malcoillánc esetén. A konjugátum tehát szérumban és savas plí-n stabil. A vegyületeket BDFj egereken vizsgáltuk, amelyekbe intraperitoneálisan P388 leukémiát ültettünk be. Az első eredmények azt mutatják, hogy a vegyülctck jelentős hatást fejtenek ki a vizsgált modellben, mivel megnövelték a túlélés idejét. Az új konjugátumok tehát előnyös és a humán terápiában felhasználható antitumor hatással rendelkeznek. A hatóanyagot előnyösen parenteráiisan, gyógyászatiig alkalmazható oldószerben oldva alkalmazzuk. „ Oldószerként alkalmazható fiziológiás sóoldat vagy más pufferolt, például foszfátpufferre! beállított oldószer. A hatóanyag dózisa általában 50 még és néhány gramm között változik. Az új hatóanyagok más antitumor szerekkel kombinálhatok. A találmány szerinti eljárást a következő példákkal világítjuk meg, az oltalmi kör korlátozása nélkül. 1. példa N-Mcíoxikarbonil-tmkinimid 3,8 g (0,04 mól) és 4 g (0,04 mól) trietil-amín 150 ml etil-acetátban felvett oldatát 0 °C hőmérsékleten 3 ml (0,04 mól) metil-kioroformát 20 ml etilacetátban felvett oldatával kezeljük. Az elegyet 1 órán keresztül keverjük, a csapadékot szűrjük és etil-aeetáttal mossuk. Az egyesített szerves fázisokat vízzel mossuk, vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk és vákuumban szárazra pároljuk. A maradékot etii-acetát/izopropil-éter elegyben kristályosítva 4,19 g N-metoxikarbonil-malcinimidet kapunk. NMR spektrum: (CDC13, 5), 6.75 (2H, s), 3.9 (3H,s). 2. példa 1 -{2,5-dioxo-3-pirrolin-l -ilj-1 -etánkarbonsav 2,3 g (0,025 mól) L-alanin 100 ml telített nátriumhidrogén-karbonát oldatban felvett oldatát 0 °C hőmérsékleten intenzív keverés közben 3,87 g (0,025 mól) N-metoxikarbonii-maleinimiddal kezeljük. Egy óra elteltével az oldatot 200 ml vízzel hígítjuk és 40 °C hőmérsékleten egy órán keresztül keverjük. Az oldatot (pH = 8,2) koncentrált kénsav segítségével pH = 6,4 értékre állítjuk. Ezután 100 ml térfogatra bepároljuk és 1 mól/liter kénsav segítségével pH = 2 értékre állítjuk. Etil-aeetáttal háromszor extraháljuk, az egyesített szerves fázisokat vízmentes nátriumszulfáton szárítjuk és vákuumban szárazra pároljuk. A maradékot szilikagélcn kloroforjn/ccctsav 95 :5 eleggyel kromatográfiásan tisztítjuk. így 1,2 g (l-(2,5- dioxo -3 -pirrolin-1 -il)- í -etánkarbonsavat kapunk. Kitermelés: 48%. IR spektrum (KBr) cnf1: 3400, 3100, 2930, 1780, 1740, 1700, 1460, 1420, 1390, 1370, i345, 1220,1175, 1118, 1080,1068,1015,970,835,700. NMR spektrum (CDC13,5): 6.7 (2H, s); 4.8 (lll,g); 1.65(3H,d). 3. példa 5-( 2,5-dioxo-3-pirrolin-J -il)-l -pentánkarbonsav 4,2 g (32,3 mmól) 5-amino-l-pentánkarbonsav 163 ml telített nátrium-hidrogén-karbonát oldatban felvett oldatát 0 °C hőmérsékleten intenzív keverés közben 5 g (32,3 mmól) N-metoxi-karbonil-maleinimiddel kezeljük. Egy óra elteltével az oldatot 256 ml vízzel hígítjuk és szobahőmérsékleten egy órán keresztül keverjük. Az oldatot (pH = 8,2) koncentrált kénsavval pH = 6,4 értékre állítjuk. Ezután 100 ml térfogatra bepároljuk és 1 mól/liter kénsawal pH = 2 értékre állítjuk. Etil-acetáttal háromszor extrabáljuk, az egyesített szerves fázisokat vízmentes nátriumszulfáton szárítjuk és vákuumban szárazra pároljuk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
