198040. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kondenzált policiklusos imidszármazékok és hatóanyagként e vegyületeket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
1 2 30. példa A találmány szerinti vegyületeket elsősorban az apomorflnnal kiváltott sztereotipiára (sztereotip viselkedésre) kifejtett gátló (antagonizáló) hatásuk szempontjából vizsgáltuk. A vizsgálat során a vegyületek in vivo dopamín-receptor-gátló hatását mérjük, ami lehetőséget nyújt annak felmérésére, hogy a vizsgált vegyületek feltehetően kiváltanak-e extrapiramidális mellékhatásokat. A vizsgálatot a következőképpen végeztük. A kísérletekhez 20 -25 g testtömegű, hím Charles River törzsű CF-1 egereket alkalmaztunk. A kísérlet megkezdése előtt egy héttel ellenőriztük, hogy az egerek pozitív sztereotfpiás választ adnak-e 10 rngfkg apomorfin szubkután adagolása után. A vizsgálati vegyületeket 0,25% Tween 80-at tartalmazó vízben szuszpendáituk vagy szolubilizáltuk, és hím egereknek több dózisszinten adagoltuk (dózisszintenként 6 állatot alkalmaztunk). Ezzel egyidőben kontrollcsoportot is vizsgáltunk, amelynek egyenlő térfogatú oldószert adagoltunk. Az intraperitoneális (i.p.) adagolás után 30 perccel, vagy az orális (p.o.) adagolás után 60 perccel mind a hatóanyagokkal kezelt, mind a kontrollállatoknak szubkután úton 10 mgjkg apomorfint adagoltunk. A befecskendezés után 5 perccel minden állat esetében feljegyeztük, hogy megfigyelhető volt-e az apomorflnnal kiváltott ágaskodó-fejbíccentés-nyaldosás tünetcsoport. A megfigyeléseket 30 perces kísérleti időtartam során minden 5 percben megismételtük. Meghatároztuk azon 5 perces pozitív negatív intervallumok számát, amelyek során az apomorflnnal kiváltott sztereotip viselkedés megfigyelhető volt, vagy nem jelentkezett. Egyszerű lineáris regressziós analízis és inverz előrejelzés segítségével megállapítottuk az EI)5o-értekeket (95%-os megbízhatósági határokkal) az apomorfinnal kiváltott sztereotípia gátlására. Standard (összehasonlító) EDj0 (és 95%-os megbízvegyületek hatósági határok) mg/kg, i.p. Haloperidol 1,37 (0,88 - 2,34) Klórpromazin 8,48 (4,69 — 16,38) Klozapln 30,06(19,42 -48,21) A találmány szerinti vegyületek e vizsgálat során hatástalannak bizonyultak: ez arra utal,hogy extrapiramidális mellékhatásaik - így a pszeudo-parkinzonizmus és a tardiv diszkinézia (késleltetett mozgási zavarok) - valószínűsége csekély. 31. példa A továbbiakban vizsgáltuk a találmány szerinti vegyületek Hmbikus D-2 dopamin-receptor-kötődésre kifejtett gátló hatását. Ez az in vitro vizsgálat megmutatja a vegyületeknek a dopamin-receptorokhoz való kötődési képességét. Várható, hogy azok a vegyületek, amelyek kötődési képessége gyenge, feltehetően nem idéznek elő extrapiramidális mellékhatásokat. A vizsgálatot a következőképpen végeztük. A patkányokat lefejeztük, és agyvelejüket gyorsan eltávolítottuk. A Hmbikus agyszövetet (nucleus accumbens, a septum területe és a szaglógumó) kivágtuk, és jégben 9-szeres térfogatú purferoldattal (50 mM Trfs-HCl, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaClj, 1 mM MgCl2, 0,1% L-aszkorbinsav, 10 pM pargílin hidroklorid, pH 7,1) 5-ös állású Polytron homogenizáló berendezésben háromszor, egyenként 15 másodperces időtartammal homogenizáltuk. A homogenizátumot 4-szeres pufferoldattal hígítottuk, majd 20 perek 30000 x g sebességgel centrifugáltuk, s utána a felülúszót elvetettük. A pelletet (centrifugakalácsot) ismét szuszpendáituk azonos mennyiségű pufferoldatban, a fentiek szerint újra centrifugáltuk, és a felülúszót ismét elvetettük. Az így kapott pelletet ismét azonos térfogatú pufferoldatban (összetételét lásd a homogenlzálásnál) szuszpendáituk, és Ixrwry módszerével mértük e készítmény fehérjetartalmát. A homogenizátumot ezután a használat időpontjáig -70 °C hőmérsékleten tároltuk. 30 pl homogenizátumot (mintánként 0,2 -0,3 mg fehérje) inkubáltunk 0.3 mN 3Hspiroperidollal (beszerezhető a New England Nuclear cégtől) és a vizsgálati hatóanyag különböző koncentrációival a fenti pufferolda! 1 ml végső térfogatában. Az inkubálást 37 °C hőmérsékletű vízfürdőben 10 percig végeztük. Az inkubálás befejezése után minden egyes próbacsőbe 3 ml hideg 50 mN-os Tris-HCl-ot (pH 7,7) adtunk, és a csövek tartalmát vákuumban, Whatman GF/B üvegrostos szűrön gyorsan átszűrtük. Ezután a szűrőket gyorsan mostuk háromszor 3 ml azonos pufferoldattal, majd szcintilládós csövekbe öntöttük és 15 percig 10 ml Hydrofluor (beszerezhető a National Diagnostics cégtől) szcintilládós koktéllal ráztuk, majd Packard 460CD műszerben szdntiiládós számlálást végeztünk. A specifikus kötődést az összes kötődés és az 1 pM (+)hutaklamol jelenlétében végbemenő kötődés különbségeként definiáltuk. A különböző koncentrációkban alkalmazott vizsgálati hatóanyag jelenlétében végbemenő kötődést a hatóanyag nélkül végbemenő specifikus kötődés százalékában fejeztük ki. Az így kapott eredményeket a kötődés százalékos értékének a vizsgálati hatóanyag koncentrádója logaritmusának a függvényében ábrázoltuk. így a lineáris regressziós analízissel egy egyenest kaptunk 95%os megbízhatósági határokkal, amelyből az ICJ0 értéket inverz (megfordított) előjelzéssel kaptuk. A vizsgálati hatóanyag gátlási állandóját Kj értékét) az alábbi képlettel számítottuk ki: lC,o Ki-----------------------H-spiroperidoI] ahol Kp = 0,3 nM a spiroperidol kötődése esetén Standard (összehasonlít) K- (és a 95%-os megbízvegyületek hatósági határok) Haloperidol 4,0 ( 3,0- 5,6)nM Klozapin 34,0 ( 23,0- 54,0)nM Flufenazin 4,5 ( 3,6- 5,6) nM Szülpirid 376,0 (174,0-5000,0) nM Néhány találmány szerinti vegyülettel kapott eredményt valamint az ismert buspiron vizsgálatának eredményét az 1. táblázatban foglaltuk össze. 98.040 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 7
