198035. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új tannin-származékok és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 2 különítjük, így kapjuk az előállítani kíva'nt eluált frakciót. Végül a fenti eljárásban kapott eluált frakcióból az eiuáló oldószert csökkentett nyomáson végzett bepárlással eltávolítjuk, így a találmány szerint előállított tannin-származék elegyet izoláljuk. A nagyteljesítményű folyadék-kromatográftában használt szivattyúk előnyösen például a Toyosoda CCPD Dual Pump (Toyosoda Kogyo), Waters 6000A- type Pump (Waters Associates), JASCO TRI ROTAR-VI Pump (Nihan Bunko kogyo), Hitachi 655-type Pump (Hitachi Seisakusho), stb. A nagyteljesítményű folyadék-kromatográfiában használt detektorok előnyösen például Toyosoda UV-8 Modell II (Toyosoda kogyo), Waters Model 440 Absorance detector (Waters Associates), JASCO UVIDEC-100-VI UV Spekctrometer (Nihon Bunko kogyo), Hitachi 638-41-type Variable-wavelength UV Monitor (Hitachi Seisakusho), stb. A kimutatáshoz megfelelő hullámhossz 280 nm. A tannin-származékok találmány szerinti előállítását közelebbről a példával szemléltetjük. Példa 3 kg porított Rhei Rhizomat 15-25 liter ioncserélt vízbe beáztatunk és szobahőmérsékleten 12-24 órán át extraháljuk. Ezt az extrakciót háromszor végezzük el, így három egyforma extraktumot kapunk. Az egyesített extraktumokat csökkentett nyomáson 4 literre koncentráljuk. Ezt a koncentrátumot oszlopgél-kromalofráfiának alávetjük (Sephadex® TH-20 /Pharmacia Eine Chemicals, 25- 100 pm, 11 x50 cm). Az oszlop eluálásához egymás után 20-20 liter vizet, víz-etanol (1 :I) keveréket, etanoit metanolt és aceton-víz (1 :l) keveréket használunk, s így frakciókat kapunk. A bepárolt négy frakció kitermelése 525, 193, 67, illetve 47 g. A 4. frakciót (36 g) alávetjük osziop-gél-kromatográfiának (Sephadex® LH-20, 5,8 x 50 cm), és az oszlopot a következő, egyenként 4 liter, etanol-víz-aceton keverékekkel eluáljuk: 100, 190,50,5, 18:1:1, 17:1,5:1,5, 16:2:2, 15:2,5:2,5, 14:33, 13:3,5:3,5, 12:4:4, 11:4,5:4,5, 10:5:5, 8:6:6, 0:1:1. A kapott 13 eluátomot egyesítve alávetjük nagyteljesítményű folyadék-kromatográíiának (szivattyú: TOYOSODA CCPD Dual Pump, detektor: TOYOSODA UV-8 Modell II, oszlop: Nucleosil 5Ctn) Macherey-Nagel, 4 x 250 mm, mozgó fázis: 14 80% acetonitril/HjO (25 mM oxálsav), áramlási sebesség: 1 ml/perc, oszlophőmérséklet: 40 °C, abszorpció: 280 nm-en). A 10- 25 perc retenciós idővel eluált frakciót elkülönítjük. Az elválasztott frakcióból az oldószert lepárlással eltávolítjuk, így végtermékként 15,6 g tannin-származékot állítunk elő. Gyógyszerészeti kiértékelés A kísérleti anyagot sóoldatban (0,9%-os NaCl) feloldjuk és egyetlen dózist használó kísérletben patkányoknak i.p, vagy p.o. beadjuk. A kontrollcsoportnak csak sóoldatot (i.p.) vagy vizet (p.o.) adunk be. 1. Kísérlet 8 8 darab, 5 -6 hetes, hím SD patkányt használunk minden egyes i.p. dózishoz (0,5, 10, 20 és 50 mg/kg). Az ún. open dield tesztben a kísérleti anyag a dózistól függően csökkent a mozgási aktivitást és a felállást. A fentiek igazolják, hogy a kísérleti anyag szedatin hatású. 2. Kísérlet 8-8 darab, 5- 6 hetes, hím SD patkányt használunk minden egyes i.p. dózishoz (0,1 és 2 mg/kg). A kísérleti anyagot 1 órával korábban beadjuk, mint a d-metamfetamint (1 mg/kg s.c.). Ismeretes, hogy a d-metamfetamin az állatoknál abnormális viselkedést idéz elő. Az 1 és 2 mg/kg kísérleti anyag gátolta a d-metamfetamin által indukált mozgási hiperaktivitást (lásd: i.Aés l.B ábra). A kísérletekből világosan kitűnik, hogy a kísérleti anyag metamfetamin elleni hatással rendelkezik. Ez az inhibitor-hatás kétszer erősebb, mint a klórpromaviné. 3. Kísérlet 10 10 darab, 5- 6 hetes, hím Wistar-king A patkányt használtunk minden egyes csoportban. Ezeknek a patkányoknak a szaglógumóit eltávolítottuk (O.B. patkányok), ami agresszív viselkedést eredményezett. A kísérleti anyag hatásait a szaglógumó kimetszésével előidézett agresszív viselkedési módokra t következő 6 paraméter alapján értékeltük ki: 1. támadás: támadási reakció, ha az állat orra elé botot tartunk, 2. ütés: ugrási vagy ijedtségi reakció, ha az állat hátsó részére ütünk, 3. beesfpés. menekülési vagy támadási reakció, ha ez állat farkát becsfpjük, 4. megfogás: küszködés! reakció, ha az állatot meg akarjuk fogni, 5. vokális: az állat hangot ad a megfigyelési időszak alatt, 6. egérölés: az állat egérölő. Ezeket a paramétereket 0 4 osztályzattal értékeltük ki. (0 pontszám = nincs reakció, 4 pontszám = maximális reakció). A végső eredményt a 6 paraméter pontszámainak az összeadásával számítottuk ki. A kísérleti anyag 1, 2 és 5 mg/kg i.p. dózisokban beadva jelentősen csökkentette az agresszív viselkedések öszszes pontszámát (2. ábra). Ez a hatás körülbelül 6 órán át tartott. Ha a kísérleti anyagot 10 és 20 mg/kg orális dózisokban adtuk be, akkor ezek a fenti i.p. beadással elértekhez hasonló gátló hatásokat eredményeztek. A fenti eredmények azt igazolják, hogy a kísérleti anyagok agresszivitás elleni hatásúak. Ez a gátló hatás tízszer erősebb, mint a haloperidolé és kétszer erősebb, mint a klórpromaziné. A fenti három kísérlet során katalepszia (merevség), ataxia (a mozgás koordinációjának a hiánya) és ízomrelaxáció (izomelemyedés) nem volt megfigyelhető. Toxikológiai kiértékelés A kísérleti anyag LDS0-értékeit, egérben a következő táblázat szemlélteti. A kísérleti anyagot sóoldatban oldottuk fel, kivéve az orális beadást, amikor az oldószer víz volt. A kísérleti állatok 4 hetes ddY hím egerek (nHO) voltak. 198.035 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
