198021. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új antiallergiás és antitrombotikus hatású heterociklusos vegyületek előállítására
1 2 A kapott termék olvadáspontja 144 146 °C. Elemzési eredmények a Ci7H13N203SF3.3/4 H20 képlet alapján: számított: C% = 51,57, H% = 3,31, N%*7,07, talált: C% = 51,63, H% = 3,27, N% = 6,73. 3. példa Az 5- és 12-liidroxi-eikozatetraénsav (5-HETE és 12-HETE, valamint az 5,12 dihidroxi-eikozatetraénsav (5,1 2-diHETE) a lipoxigenáz kaszkád korai arachidonsav-oxldációs-termékei, amelyekről ismert, hogy közvetítő szerepünk van a gyulladásos és allergiás válaszreakciók néhány fajtájában. Ez különösen igaz az 5,12-diHETE esetén, amelyet LTB4-ként is jelölnek (lásd a Frod-Mitchinson, J. Roy. Soc. Med., 74 831 (1981) szakirodalmi helyen). Az ebben a példában ismertetett vizsgálattal a találmány szerint előállított vegyületeknek azt a képességét mérjük, hogy gátolják az 5-HETE és az LTB4 patkány glikogénnel létrehozott polimorf magvú leukocitál által történő szintézisét. A vizsgálatot a következő módon végezzük: 150 -250 g test tömegű, nőstény Wistar patkányokból 10 ml 6%-os glikogén i.p. beinjektálása után peritoneális polimorf magvú leukocltákat nyerünk ki. A patkányokat a glikogén beadása után 24 órával szén-dioxiddal megfojtva leöjjük.ésa peritoneális sejteket a peritoneum Ca és Mg mentes Hanks féle kiegyensúlyozott oldattal (HBSS) való mosásával összegyűjtjük. A peritoneális váladékot 10 percig 400 g-n centrifugáljuk, majd a mosófolyadékot eltávolítjuk és a sejteket tartalmazó szilárd anyagot Ca -t és Mg -t, valamint 10 mniól/1 L-ciszteint tartalmazó HBBS-tal 2 x 107 sejt/ml koncentrációjúra szuszpendáljuk. 1 ml sejtszusz penzióhoz a vizsgálandó hatóanyagot vagy a hordozóanyagot adjuk és az elegyet 10 percig 37 °C-on ikubáljuk. Ezt az előinkubálást követően 10 jumol/1 Kalcium ionofor A23187-t és 0,5 pCiu (* C) arachidonsavat adunk az elegyhez, és az inkubálást 10 percig folytatjuk. A reakciót ezután 3 ml hideg víz adagolásával és az elegy pH = 3,5-re való savanyításával leállítjuk. Ezt követően a lipoxigenáz-termékeket dietil-éterrel kétszer extraháljuk. Az összegyűjtött éteres extraktumokat nitrogéngáz atmoszférában szá- - razra pároljuk és a visszamaradó anyagot kevés metanolban oldjuk, majd alumíniumfóliára gyárilag felvitt adszorbensből álló vékonyrétegkromatográfiás lemezre cseppentjük, és megbízható 5-HETE, 12-HETE és 5,12-diHETE referenciaanyaggal hexán - éter ecetsav 50 : 50 : 3 oldószerrendszerben kromatografáliuk. A kromatografálás elvégzése után az 5-HETE- nek és az 5,12-diHETE-nek megfelelő területeket autoradiográfiásan azonosítjuk, kivágjuk és folyadék-szcintillációs méréssel mennyiségileg meghatározzuk. Az eredményeket a (14C)5-HETE és a (MC)LTB4 (5,12-diHETE) szintézis %-os gátlásaként kifejezve adjuk meg. kontroli-vizsgáit % gátlás ------------------------. 100 kontroll A találmány szerint előállított vegyületek vizsgálata során, a fenti eljárásban referenciaanyagként a 3- -amino-1 -[m-(trifluor-metil)-fenil]-2-pirazolin antloxidánst (BW755C) alkalmazva a következő eredményeket kaptuk. 1, Táblázat Az előállítási 50%-os gátlást adó koncentráció pé Ida száma (1C5 0 jrmol) 5-HETE LTB4 BW755C ÍB 43.0 1,6 30,0 2,1 Más, a találmány szerint 100 /zmol szinten vizsgálva értékeket kaptuk: előállított vegyületeket a következő %-os gátlás Az előállítási példa száma %-os gátlás 100 jumol-nál 5-HETE LTB4 IA 93 85 További, találmány szerint előállított vegyületeket vizsgáltunk 50 jmiól szinten, azokat a vegyületeket, amelyek >505?' gátlást okoztak a következő táblázatban jellel jelöljük. Az előállítási >50% gátlás példa száma 50pmol-nál ID IE Az eredmények azt mutatják, hogy a találmány szerint előállított vegyületek jelentős aktivitással bír nak az 5-HETE és az LTB4 arachidonsav lipoxigenáz oxidációs-termékek szintézisének gátlásában. 4. példa A 3. példa szerinti vizsgálati eljárást a találmány szerint előállított vegyületeknek az arachidonsav cik looxlgenáz út TxB2 oxidációs termékének szintézisére kifejtett gátló hatásának meghatározására is alkalmazzuk. A vizsgálatot a 3. példában leírt módon végezzük, azonban a ciklooxigenáz aktivitás meghatározására a mintákat megbízható TxB2 referenciaanyaggal együtt kromatografáljuk etil-acetát - hangyasav 80:1 elegyből és etil-acetát — izooktán acetsav — víz 110 : 50 : 20 : 100 oldószerelegy felső fázisából álló oldószerrendszerben. A kromatografálást követően a TxBa-nek megfelelő helyeket autoradiográfiásan azonosítjuk, kivágjuk és folyadék-szcintillációs méréssel menynyiségileg meghatározzuk. Az eredményeket a 3. példában megadott módon számítjuk ki. Az eredmények a következők. II. Tábláhat Az előállítási % gátlás 100 jrmol-nál példa száma 1A 56 1B 73 Más, a találmány szerint előállított vegyületeket 50 jLtmol szinten vizsgáltunk, azokaz a vegyületeket, amelyeknél > 50% gátlást észleltünk + jellel jelöHiÜc. Az előállítási 50% gátlás 50 /rmof-nál példa száma 1D * 1E Az eredmények azt mutatják, hogy a találmány szerint előállított vegyületek az arachidonsav cikloocigenáz-oxidádós termékének a TxBa-nek a szlnté-98.021 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 5
