197944. lajstromszámú szabadalom • Eljárás chanoclavin előállítására
197944 1 A találmány tárgya eljárás chanoclavin előállítására, melyet az jellemez, hogy a DSM 2837 számon deponált Claviceps spec, mikroorganizmust tenyésztjük és a fermentáció befejezése után a képződött chanoclavint izoláljuk. Ismert tény, hogy a chanoclavint (: 2-metil-3- [ 1,3,4,5-tetrahidro-4- (metil-amino) -benz[cd] indol-5-il] -2-propen-l-ol :) elővegyületként lehet használni farmakológiailag hatásos ergotalkaloidok bioszintéziséhez, így — többek között — farmakológiailag hatásos vegyületek előállításához (lásd: J. Med. Chem. 17, 1974, 300) lehet hasznosítani. Azt találtuk, hogy egy Claviceps spec, gombatörzs magas kitermeléssel és másféle ergotalkaloidoktól gyakorlatilag mentesen képes a tenyésztési közegben chanoclavint termelni. Az említett Claviceps spec, törzset egy vadon termő rozsnok (Bromus) anyarozsából izoláltuk. A törzset — vállalaton belüli használatra — a SCHERING MBCE 373113 megjelöléssel láttuk el, és azt a Német Szövetségi Köztársaság Mikroorganizmus Gyűjteményénél (Deutsche Sammlung für Mikroorganismen) DSM 2837 szám alatt depo náltuk. A törzs szénforrásként glükózt vagy szacharózt és nitrogénforrásként aszparagint, ammónium-szukcinátot vagy ammónium-citrátot tartalmazó agar-táptalajon tömör, erősen redőzött, fehér telepeket képez. A telepek hifákból állnak, a színük idővel vöröses árnyalatú lesz és azokban egy idő múlva erősen fénytörő vakuolák láthatók. A hifák átmérője: 3—4 pm. Konidiumok nem képződnek. A telep átmérője 10 napig tartó tenyésztés után: 3—4 cm, 20 napos tenyésztés után: 6—7 cm. A találmány szerinti eljárást olyan körülmények között valósítjuk meg, melyeket rendszerint anyagcserén alapuló szintézisre szolgáló gombakultúrák tenyésztésénél szoktak alkalmazni. így az általában szokásos előkísértetekkel előbb meghatározzuk a legalkalmasabb fermentációs körülményeket, mint pl. kiválasztjuk a legmegfelelőbb táptalajt, a technikai körülményeket, mint pl. a hőmérsékletet, a levegőztetés mértékét, a pH-értéket, valamint a mikroorganizmus fejlődésének és germinációjának optimális idejét. A fermentációs közegben szénforrásként például glükózt vagy szacharózt használhatunk. A nitrogénforrás — többek között — aszparagint, ammónium-szukcinát vagy ammónium-citrát lehet. A táptalaj tartalmaz még a növekedés serkentésére szükséges anyagokat, példának okáért élesztőkivonatot, továbbá ásványi anyagokat, így kálium-, magnézium-, kalcium-, vas- és cinkkationokat, valamint szulfát-, foszfát-, nitrát- és kloridanionokat, a szokásosan alkalmazott koncentrációkban. A fermentációt egy vagy két lépésben lehet lefolytatni, mimellett az előfermentáláshoz alkalmazott közeg a főíermentálás közegével azonos lehet, vagy attól különbözhet. 2 2 A tenyésztési és a szaporítási műveletek során előnyösen alacsony koncentrációban alkalmazzuk a szénforrást (10—100 g/1), míg magánál a chanoclavin előállításánál a szénforrást előnyösen magasabb koncentrációra (100—300 g/liter) állítjuk be és szénforrásként előnyösen glükózt használunk. A fermentáció kezdetén a közeg pH-ját előnyösen 4 és 6 közötti értékre állítjuk be. A tenyésztést kb. 10—35°C közötti hőmérsékleti határok között végezzük, a 20—30°C hőmérséklet-tartomány előnyös. A tenyésztést szigorúan aerob körülmények között valósítjuk meg, és az optimális fermentációs időt a szokásos módon, a képződött chanoclavin analitikai meghatározásával állapítjuk meg. A fermentáció befejeződése után a keletkezett chanoclavint önmagában véve ismert módon izoláljuk. Példul úgy járunk el, hogy a fermentálással kapott sarzsot valamilyen vízzel nem elegyedő szerves oldószerrel, így etil-acetáttal, metil-izobutil-ketonnal, diklór-metánnal, kloroformmal vagy tetraklór-etánnal extraháljuk, a kivonatokat bepároljuk és a kapott nyers terméket kromatografálással és/vagy kristályosítással tisztítjuk. Az alábbi kiviteli példa a találmány szerinti eljárás tüzetesebb megmagyarázására szolgál. Példa Claviceps spec. DSM 2837 mikroorganizmust az alábbi összetételű táptalajon tenyészttünk: Szacharóz (100 g/l), citromsav (10 g/1), élesztőkivonat (0,1 g/1), kálium-dihidrogén-foszfát (500 mg/1), magnézium-szulfát-heptahidrát (300 g/1) ,ammóníum-szulfát (69 mg/ /l), kalcium-citrát-tetrahidrát (1 g/1), vas-szulfát-heptahidrát (7 mg/1), cink-szulfát-heptahidrát (6 mg/1). A táptalaj pH-ját 5,1 értékűre állítjuk be. Ezt a nevelőtenyészetet 14—28 napon át 30°C hőmérsékletű inkubátorban tartjuk. Kb. 1 cm2-nyi micéliumdarabot steril körülmények között egy Ultraturrax-berendezés segítségével felaprítunk 5 ml élettani konyhasóoldatban és ezzel beoltunk egy 500 ml-es Erlenmeyer-lombikban levő 50 ml előfermentációs közeget, amely 5,1 pH-ra beállítva és glükózt (50 g/1), citromsavat (7,5 g/1), kálium-dihidrogén-foszfátot (500 mg/1), magnézium-szulfát-heptahidrátot (300 mg/1), ammónium-nitrátot (6 g/1), kalcium-nitrát-tetrahidrátot (1 g/1), cink-szulfát-heptahidrátot (6 mg/1), vas(II)-szulfát - heptahidrátot (7 mg/1), valamint élesztőkivonatot (100 mg/ /1) tartalmaz. Ezután az előtenyésztést 4 napon át, 24°C hőmérsékleten és 220 fordulat/ /perc sebességgel egy forgó-rázó berendezésben végezzük. Az így kapott előtenyészet 5 ml-nyi menynyiségét hozzáadjuk egy 500 ml-es Erlenmeyer-lombikban levő 50 ml táptalajhoz, amely 5,1 pH-ra van beállítva és az alábbi komponensekből áll: szacharóz (200 g/1), 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
