197938. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interleukin-2-polipeptidet kódoló gén, ezt a gént hordozó rekombináns DNS, a rekombináns DNS-sel rendelkező élő sejtvonal előállítására és eljárás interleukin-2 előállítására ilyen sejtekkel
197938 26 inkubáljuk 37°C hőmérsékleten egy 50% formamidot, 20 mmól/liter Pipes puffert (pH 6,5), 0,75 mól/liter NaCl-t, 3 mmól/liter EDTA-t, 0,2% SDS-t és 250 pg, indukált J-III sejtekből származó poli(A)mRNS-t tartalmazó oldatban abból a célból, hogy a szűrőn rögzített DNS-t hibridizáljuk IL-2 mRNS-sel. Ez után a szűrőt 65°C hőmérsékleten háromszor mossuk 10 mmól/liter Pipes-t (pH 6,5), 0,15 mól/liter NaCl-t tartalmazó, majd 1 mmól/liter Pipest, 10 mmól/liter NaCl-t tartalmazó oldattal, majd kezeljük 0,5 mmól/ /liter EDTA-t és 0,1% SDS-t tartalmazó oldattal 95°C hőmérsékleten 1 percen át, hogy visszanyerjük a hibridizált mRNS-t a szűrőről. Az így extrahált mRNS-t oligo dT-cellulóz oszlopon tisztítjuk hagyományos módszerrel, és Xenopus oocitákba injektáljuk, hogy meghatározzuk a transzlációval átalakult fehérje IL-2 aktivitását. A 18 csoportból egy (minden csoport 24 kiónt tartalmaz) ad pozitív, 48 egység/ml IL-2 aktivitást 3H-TdR beépülési vizsgálat alapján, amelyet korábban ismertettünk, míg a többiek világosan negatívak. A pozitív csoportba tartozó 24 egyedi telepet ez után inokuláljuk 200 ml, a korábban leírt összetétellel azonos L-tápközegben, aerob körülmények között tenyésztjük 5— 7 órán át 37°C hőmérsékleten és hasonlóképpen klóramfenikolt tartalmazó friss L-táp-25 közeget adunk ismét hozzá. A plazmid DNS kiegészülése után egy éjszakán át történő tenyésztéssel, a plazmid DNS-t a standard eljárás szerint tisztítjuk. Az egyes plazmid 5 DNS-ek mintegy 5 pg-jának elhasítása után Hind III-mal, minden egyes plazmid DNS-t hasonlóképpen nitrocellulózhoz kötünk. A szűrőket hibridizáljuk IL-2 mRNS-sel és a hibridizált mRNS-t kinyerjük, hogy Xenopus fö oocitákba injektálhassuk a transzlációval átalakult fehérje IL-2 aktivitásának meghatározása érdekében. Amint a 2. Táblázat bemutatja, csak egy telepből tisztított plazmid DNS, p3-16-ként 15 jelzett, ad pozitív IL-2 aktivitást. Ezért ezt a kiónt azonosítottuk, mint IL-2 cDNS-sel rendelkező kiónt (E. coli K 1776) p3-16 AJ 11995 (FERM-BP-225). így a p3-16 plazmid DNS- ről bebizonyult, hogy része az a DNS (IL-2 20 gén), amely képes specifikus hibridet képezni IL-2 mRNS-sel. A p3-16 cDNS inzertje olyan jellegzetességeket mutat, hogy hasítható Xbal restrikciós enzimmel egy egyedi helyen és BstNI-el két 25 helyen (egy azonos irányban és egy ellenkező irányban az Xbal hasítási helyhez). A p3-16 plazmid egy mintegy 650 bázispárt tartalmazó cDNS inzertet tartalmaz, amely látszólag megfelel a 11-12S IL-2 mRNS egy részé- 30 nek. 2. Táblázat /a/ Minta Hígítás 3H-TdR befogadás / cpm/ Az IL-2 mennyisége/egység/ml/ I. Kontroll __ _ 2,010 0 /Közeg a meghatározáshoz/ II. Kontroll X2 2,120 0 /a nem kezelt tojás tápközeg-folyadékj ának felülúszója/ X32 2,482 mRNS transzlációs X2 20,453 58 terméke X32 20,961 /b/ Minta Hígítás T-limfocita sejt-Az IL-2 mennyiszám/sej t/üreg/ sége/egység/ml/ I. Kontroll __ 0 0 /Közeg a meghatározáshoz/ II. Kontroll X2 0 0 /a nem kezelt tojás X32 14
