197937. lajstromszámú szabadalom • Eljárás plipeptidek mikrobiológiai gazdasejtekben való kifejezésére használható új klónozó hordozók előállítására
197937 fehérszínű, ampicillinre rezisztens transzformánsokat szelektáljuk, ezzel megállapítjuk, hogy a teljes lacl gént újra előállítottuk. A transzformánsok egyikéből izoláljuk a plazmid dezoxi-ribonukleinsavat, ennek szerkezetét a 29. ábra 165. jellel jelölt részén adjuk meg. A plazmidot pYM058 jellel jelöljük. 4) A pYM061 plazmid és más, autoregulált kifejeződő plazmidok előállítása Az első autoregulált, indukálható, kifejeződő pIN-III sorozatba tartozó plazmid előállításának utolsó lépéseként a lacl gént beépítjük a pKEN045 (pIN-II, A-1) plazmidba. Ügy járunk el, hogy 30 pg pYM058 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat 100 egység EcoRI restrikciós enzimmel kezelünk 250 pl EcoRI-pufferban, 1,5 órán át, 37°C hőmérsékleten. Az előzőekben megadottak szerint eljárva agaróz gél-elektroforézissel tisztítunk egy 2,4 kb nagyságú EcoRI fragmenst. 2,0 pg mennyiségű fragmenst ezután 600 egység Sl-nukleázzal kezelünk 150 pl Sl-pufferban, 1 órán át, 20°C hőmérsékleten. A reakció leállítására 15 pl, 500 mmólos trisz-hidrogén-kloridot (pH=8,0) és 15 pl, 250 mmólos etilén-diamin-tetraecetsav-oldatot adagolunk, majd fenollal extrahálunk. A fenol és a cinkionok eltávolítására éterrel extraháljuk az elegyet, és O.OlXSCC oldattal szemben kétszer dializálunk 4°C hőmérsékleten, 1,5 órán át. A dezoxi-ribonukleinsavat etanolos kicsapással különítjük el. 10 pg pKEN045 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat 1 egység Hindi restrikciós enzimmel részlegesen emésztünk 751 pl Hind III pufferban, 30 percen át, 37°C hőmérsékleten. Ahogy azt a 29. ábra 166. számmal jelzett részén bemutatjuk, a pKEN045 két Hindi hasítási helyet hordoz; az egyik Sáli enzimmel is hasítható. A Hindi restrikciós enzimmel végzett részleges emésztéskor lineáris dezoxi-ribonukleinsav-fragmensek keverékét kapjuk, a leghosszabbak csak egy Hindi helyen hasadtak. Ezeket a körülbelül 5,0 kb hosszúságú fragmenseket 0,7% agarózt tartalmazó gélen elektroforézissel izoláljuk, ahogy azt az előzőekben megadtuk. 2,5 pg linearizált dezoxi-ribonukleinsavat ezután 0,15 egység BAP-val kezelünk 50 pl BAP-pufferban, 37°C hőmérsékleten, 1 órán át a Hindi tompa végek önmagukkal való kapcsolódásának meggátlására. A BAP teljes eltávolítására háromszor fenollal extrahálunk. A dezoxi-ribonukleinsavakat ezután etanolos kicsapással izoláljuk és csökkentett nyomású térben szárítjuk. 0,15 pg, a pYM058 plazmidból származó 2,4 kb nagyságú EcoRI fragmenst 0,3 pg, a pKEN045 fragmensből származó, 5,0 kb nagyságú fragmenssel keverünk, és az elegyhez 400 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázt adunk (New England Biolabs), 15 pl ligáz-pufferban, amelyhez előzőleg 0,8 mmól/ /I adenozin-trifoszfátot adunk. A reakciót 55 16 órán át végezzük 12,5°C hőmérsékleten. 10 pl ligációs eleggyel E. coli W620 recA (NRRL B-15024) törzset transzformálunk, és az ampicillinre rezisztens transzformánsokat az előzőekben megadottak szerint szelektáljuk X-gal-t használva. A fehérszínű telepek bizonyítják a lacl gén beépülését az AmpR géntől jobbfelé haladva, a Hindi helyre. A transzformáció során olyan plazmidok keletkeznek, amelyek a lacl gént két különböző orientációban hordozzák, ezek egyikének szerkezetét a 29. ábra 167 helyén adjuk meg. Ennek a plazmidnak a pYM061 (pIN-III, A-l) jelet adtuk. Több módszer áll rendelkezésünkre, amelyekkel az A-2 és A-3 leolvasási sémának megfelelő pIN-III plazmidokat előállíthatjuk. Figyelembevéve az A-2 és A-3 plazmidok rendelkezésre álló pIN-I és pIN-II sorozathoz tartozó párjait, az egyik módszer szerint az előzőekben a pKEN045 plazmid kapcsán és a 29. ábrán megadottak szerint eljárva a lacl gén-fragmenst beépítjük a pKEN049 (pIN-II, A-2) és pKEN050 (pIN-II, A-3) plazmidokba. Előnyösen eljárhatunk oly módon is, hogy a pKEN049 és pKEN050 (vagy a pKEN039 (pIN-I, A-2) és a pKEN040 (pIN-I, A-3)) plazmidok kisebb Xbal-EcoRI fragmenseit helyettesítjük a pYM061 plazmid kisebb Xbal-EcoRI fragmensével. Ebben az esetben a 15. ábra kapcsán az előzőekben megadottak szerint járunk el, és megkapjuk a pIN-III sorozatba tartozó A-2 és A-3 típusú plazmidok at. Másrészről, meggondolva, hogy a megfelelő pIN-I konstitutív és pIN-II indukálható plazmidokat még nem állítottuk elő, az autoregulált, indukálható A-2 és A-3 plazmidokat közvetlenül előállíthatjuk a pYM061 (A-l) plazmidból. A pYM061 plazmid EcoRI hasítási helyének szomszédságában lévő dezoxi-ribonukleinsav-szekvencia módosítható a 13. ábra b. és c. részén, vagy a 14. ábra b. és c. részén szemléltetett módon, amikor közvetlenül megkapjuk a pIN-III, A-2 és A-3 szerkezetű plazmidokat. Ezen plazmidok előállításának ez a legelőnyösebb módja, mivel ebben az esetben nincs szükségünk a megfelelő pIN-I és pIN-II plazmidok előállítására. Ugyancsak több módszer áll rendelkezésünkre a B- és C-beépítési helyet magába foglaló pIN-III plazmidok előállítására. Mivel a pIN-I és a pIN-II plazmidokat már előállítottuk, ezek a 29. ábrán megadottak szerint módosíthatók oly módon, hogy a lacl gén-fragmenst beépítjük, vagy előnyösebben, a pYM061 (pIN-III, A-l) kisebb Xbal-EcoRI fragmensét helyettesítjük a B- illetve C-helyet tartalmazó konstitutív vagy indukálható plazmidok kisebb Xbal-EcoRI fragmenseivel, amiután mindegyik esetben pIN-III típusú, B- vagy C-helyet hordozó plazmidokhoz jutunk. A pYN-III kifejeződő plazmidokat azonban legelőnyösebben úgy állítjuk elő, hogy kihagyjuk a pIN-I vagy 56 29 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
