197931. lajstromszámú szabadalom • Eljárás magas antitrombotikus aktivitású mukopoliszacharid kompozíciók előállítására
197931 akcióelegyet 45 percen át állni hagyjuk, majd a nitritionból való mentességet keményítő és kálium-jodid keverékével átitatott indikátorpapírral ellenőrizzük (kékesiboiya szín fejlődik ki NOj-ionok jelenlétében). A reakcióelegyet a nitritionok teljes eltűnéséig hagyjuk állni, minden harmadik vagy negyedik percben ellenőrzést végezve az említett indikátorpapírral. Amikor ezeknek az ellenőrzéseknek a során negatív eredményt észlelünk, azt az időpillanatot tekintjük a reakció befejeződése pillanatának. A reakcióelegy (amelyben a depolimerizált frakció molekulatömege átlagosan 250 dalton) pH-értéííét ezt követően 10-re növeljük tömény nátrium-karbonát-oldat adagolása utján, majd 5 g nátrium-bór-tetrahidridet adagolunk. Az így kapott reakcióelegyet 15 órán át keverjük, majd ezt követően a reakcióba nem lépett nátrium-bór-tetrahidridet elbontjuk a reakcióelegy pH-értékének tömény sósavval 3-ra való beállítása útján. Ezután a reakcióelegyet 15 percen át keverjük, majd pH-értéket 7,0-ra állítjuk tömény nátrium-karbonát-oldattal. fgy a 2,5-anhidro-mannóz végcsoportokat 2,5- -anhidro-mannit végcsoportokká alakítjuk. A reakciótermékeket 10 liter etanol adagolásával különítjük el. 48 órás állás után a terméket dekantálással elkülönítjük és a felülúszó folyadékot eltávolítjuk. A kapott termék USP-titere 32 lU/mg, Yín és Wessler titere 164 IU/mg, így az arány 5,1. (IU nemzetközi egységet jelent.) A csapadékot 9 liter ionmentesített vízben újraoldjuk, majd az oldathoz 100 g nátrium-kloridot adunk és pH-értékét 3,8-ra csökkentjük tömény sósavval. Ezután a térfogatot pontosan 10 literre beállítjuk ionmentesített vízzel, majd intenzív keverés közben 10 liter etanolt adagolunk. Az ekkor kapott elegyet 48 órán állni hagyjuk. A felülúszó folyadékot leszívatjuk és félretesszük. A csapadékot elkülönítése után etanollal mossuk, őröljük és vákuumban szárítjuk. így 230 g mennyiségben a következő paraméterekkel rendelkező terméket kapunk. USP-titer = 52 IU/mg Yin-Wessler titer = 225 IU/mg YW, USP titerek aránya = 4,3 Átlagos molekulatömeg = 4000—5000 dalton 5 Az átlagosnál alacsonyabb szulfáttartalmú láncok eltávolítását a következő kísérletekkel bizonyítjuk. összehasonlítjuk az 1) 1. példa szerinti termékben (a következőkben a CY 216 D kódszám alatt említjük) lévő glükóz-amino-gükán láncok, és a 2) a nátrium-kloridot tartalmazó víz és etanol elegyével végrehajtott frakcionálás során kapott felülúszó folyadékban maradt láncok szuifatálási fokát. Az 1) és 2) pont szerinti láncokat gélszűréssel különítjük el, majd konduktometriásan meghatározzuk a szuifatálási fokot. Kísérleti módszer Az 1. példa szerinti frakcionálásnál kapott felülúszó folyadék pH-értékét 7,0-ra beállítjuk 5N vizes nátrium-karbonát-oldattal, majd 19 liter etanolt adunk hozzá. Az így kapott elegyet 48 órán át állni hagyjuk, majd etanollal mossuk, porítjuk és vákuumban megszárítjuk. így 120 g mennyiségben oligoszacharid-keveréket kapunk. Az így kapott keverékből 60 g-ot feloldunk 500 ml 0,5 mólos vizes nátrium-klorid-oldatban, majd a kapott oldatot felvisszük Ultragel Ac A 202 (gyártója: IBF, Villeneuve La Garenne, Franciaország) oszlop tetejére. Az eluátum 214 nm-nél mérhető ibolyántúli fény abszorpcióját közvetlenül rögzítjük. A különböző oligoszacharid-frakciókat elválasztjuk egymástól, majd kétszeres térfogatmennyiségü etanollal kicsapjuk. A kapott frakciók polimerizációfokát nagy nyomású folyadékkromatográfiás módszerrel. Waters 1 60 márkanevű töltőanyagot (gyártója: Waters Millipore, St. Quentin en Yvelines Franciaország) tartalmazó oszlopon határozzuk meg, a kalibráláshoz ismert molekulatömegű oligoszacharidokat használva. Az egyes frakciók szulfát/karboxil arányát Casu, B, és Gennaro, V. által a Carbohydr. Rés 39. 168—176 (1975) szakirodalmi helyen ismertetett konduktometriás módszerrel határozzuk meg. Az előzőekben ismertetett módon járunk el a CY 216 D esetében is. Eredmények A CY 216 D-ből, illetve a felülúszó folyadék ból elkülönített oligoszacharidok jellemzőit a következő táblázatban adjuk meg. 6 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 4
