197930. lajstromszámú szabadalom • Eljárás alacsony viszkozitású, nagy molekulájú, szűréssel sterilizálható hialuronsav előállítására
1 A találmány tárgya eljárás alacsony viszkozitású, nagymolekulájú és szűréssel sterilizálható hialuronsav előállítására. Ismert, hogy a hialuronsav és sói (HA) előnyösen alkalmazhatók a szem- vagy ízületi folyadék pótlására (például 4 141 973., 4 517 795.és 2 975 104. számú USA-beli szabadalmi leírások). A hialuronsavat vagy sóit a legtöbb célra nagy móltömegű polimer formájában alkalmazzák. A HA-termékek, így a Hylartil (Pharmacia, a 4 14'! 973. számú USA-beli szabadalmi leírás alapján) nagy móltömegűek, azonban nagy viszkozitásúak is. Az ilyen nagy viszkozitású termék néhány célra előnyösen alkalmazható (például adhézióképződés csökkentése sebészeti beavatkozások után), az injekciós célra felhasznált HA azonban előnyösen alacsony viszkozitású és szűrhető, vagyis szűréssel sterilizálható. Néhány új extrakciós eljárás alacsony viszkozitású HA-t eredményez, ennek azonban móltömege is alacsony (Sterivet-termék, 4 517 195. számú USA-beli szabadalmi leírás, valamint Shimada és Matsumura, 1975). Ez a termék nyilvánvalóan rendelkezik bizonyos előnyökkel az injektálhatóság vonatkozásában, azonban alacsony móltömege miatt nagyobb dózisban (5,0 ml Sterivet a 2,0 ml Pharmacia termékkel szemben) kell alkalmazni. Ezenkívül a Sterivet HA szűréssel nem, csak hővel sterilizálható. Nem ismert olyan eljárás, amely lehetővé teszi nagy móltömegű HA alacsony móltömegű HA-ból történő előállítását. Az irodalomból ismert azonban egy olyan eljárás, amely a viszkozitást a pH beállításával csökkenti (Mitra és munkatársai: 1983; Mitra, Raghunathan és munkatársai, 1983 és Sheenan és munkatársai 1983). Az irodalomban a molekulatömegről nem tesznek említést, azonban a reverzibilis pH értéket a HA molekula konformáció változásával hozzák összefüggésbe. Elméleti fejtegetésük szerint a lecsökkenteti viszkozitás feltehetően a polimer megnövelt rugalmasságára vezethető vissza, ami a rend/ /rendetlenség átmenet következménye. Ez azonban a polimer instabilitására és ennek következtében alacsonyabb móltömegre utal. Swann (1969) felvetette, hogy a viszkozitás a hidroxilcsoportok ionizálásával és a csoportok közötti hidrogén-hidaknak az a-Helix-szerkezet statisztikai csavarodáson belüli felszakításával csökkenthető. Érdekes módon ez a jelenség a magas pH-val elért viszkozitáscsökkenést a pH=3,0 érték alá történő csökkentésével teljes mértékben megfordítja. A valóságban mintegy pH = 2,5 értéknél egy viszkoelasztikus ragacs keletkezik. (Gibbs és munka* társai, 1968). Érdekes továbbá, hogy a magas pH-nál alacsony viszkozitású J4A szűréssel csak nehezen sterilizálható. A szűrő előtt egy gélréteg alakul ki, ami a nagy térfogatú szűrést gyakorlatilag lehetetlenné teszi. 2 2 Viszonylag egyszerű és új eljárást találtunk nagy molekulájú és nagy viszkozitású HA (célszerűen nátrium-hialuronát, NaH) előállítására, melyet nagy átlagos móltömeg (előnyösen 1,2x10® feletti), szűk móltömegtartomány, alacsony viszkozitás (előnyösen mintegy 5-10-4 m2/s alatt 1 tömeg%-os oldatban 37°C hőmérsékleten), nagyfokú tisztaság (1,25 mg/ /ml alatti, előnyösen 0,1 mg/ml alatti fehérje vagy aminosav, HPLC vagy UV spektrometria segítségével mérve és 45 mg/ml alatti, előnyösen 5,0 pg/ml alatti nukleinsav a fenti technikákkal mérve) jellemez. Az alacsony viszkozitású HA, amely nagy móltömeggel és szűk móltömegtartománnyal rendelkezik, előállítható a HA oldat szabályozott hőkezelésével. Meglepő módon a viszkozitás csökkentés fenti módszerei nem közvetlenül reverzibilisek, mint a pH változás említett folyamata, és a viszkozitás csökkentésével egyidejűleg nem csökkenti a móltömeget. A viszkozitáscsökkentés említett módszerei ezenkívül lehetővé teszik a HA szűréssel történő sterilizálását is, míg a pH beállításával csökkentett vizskozitású termék nem szűrhető. A hőkezeléssel végzett viszkozitáscsökkentésnél az idő és hőmérséklet hatása összeadódik. Minél hosszabb ideig végezzük a hőkezelést egy állandó hőmérsékleten (célszerűen 50—70°C közötti hőmérsékleten), annál alacsonyabb lesz a viszkozitás. Ha viszont a hőmérsékletet 121°C értékkel emeljük, az adott viszkozitást rövidebb idő alatt elérjük. A túl magas hőmérséklet és túl hosszú idő azonban (60 perc felett és 121°C hőmérséklet felett) karamellizálódást és bizonyos hidrolizálódást okoz, ami nemkívánatos módon csökkenti a móltömeget. A szűrési technika alkalmazása esetén szűkpórusú membránként közepes pórusnagyságú, előnyösen mintegy 1 pm alatti, elsősorban 0,5 pm alatti pórusnagyságú membránt alkalmazunk. A találmány szerinti eljárással előállított HA terméket viszonylag magas móltömeg (például legalább 1 000 000, előnyösen legalább 1 800 000) és mesterségesen beállított viszkozitás (például mintegy 5-10-5 m2/s alatti, előnyösen mintegy 1,5* 10-4 m2/s alatti viszkozitás a nátriumsó 1 tömeg%-os vizes oldatában mérve) jellemzi. A viszkozitás csökkentésére szolgáló találmány szerinti eljárást, amelynek során a nagy közepes móltömeg jelentős mértékben nem csökken, a következő példákkal és táblázatokkal világítjuk meg közelebbről (ellenkező értelmű megjelölés hiányában a móltömeget FPLC segítségével határoztuk meg és a viszkozitás NaH 1 tömeg%-os vizes oldatára vonatkozik 37°C hőmérsékleten). A nagy móltömegű és nagy viszkozitású HA előállításához egy, a HA-t vagy NaH-t nem oldó fürdőbe merülő, folyamatosan mozgó rudazatot alkalmazunk, amelyen a kiváló HA vagy NaH megtapad. A mozgó rudazat, amelyet a továbbiakban tekercselőnek nevezünk, a folyékony közegnek, amelyben a HA kicsapó-197930 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
