197929. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ciklikus dezprolin-vazopresszin vazopresszin-antagonista vegyületek és a fenti vegyületeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
197929 híg vizes oldatban lévő dimerkapto-oktapeptidet 0,01 mól/1 koncentrációjú kálium-[ferri-cianid] -oldattal ciklizáljuk pH 7,2 értéken, míg a szín 30 percen át megmarad. Az oxidációs reakció befejeztével az oldat pH-ját jégecettel 4,5-re állítjuk. A kapott oldatot enyhén savas akrilgyantával töltött oszlopon (Bio-Rex 70; 2,5X12 cm) lassan átfolyatjuk. Az oszlopot 30:4:66 arányú piridin-ecetsav - víz puffereleggyel eluáljuk. A piridin-acetát-oldatot vákuumban végzett desztillálással eltávolítjuk. 420 mg (40%) cím szerinti nyersterméket kapunk, melyet az alábbi módon tisztítunk. 1) Ellenáramú megoszlás (CCD): minta: 250 mg, n-butanol-ecetsav-víz (4:1: :5), 240 frakció a) 167—189. frakcióból 83 mg termék b) 160—166 és 190—196. frakcióból 14 mg termék. 2) Preparatív HPLC: minta: 50 mg (la. lépésből), Altex ODS, 10 mmX25 cm 5u, áramlási sebesség: 4 ml/perc, víz-acetonitril-TFA (60:40:0,25) izokratikus, 220 nm (2,0 AUFS), injektálás 6,25/0,5 ml, 24,3 mg tiszta vegyületet izolálunk. Fizikai adatok: molekula összegképlete: C48H70N12O,0S2 relatív móltömeg: 1038,46 aminosav-analízis: Asp (1,00), Gly (1,00), Cys (0,56), Val (0,96), Tyr (0,70), Phe (0,96), Arg (0,96). Kromatográfiás adatok: Vékonyréteg-kromatográfia (TLC) eluens: butanol-ecetsav-víz-etil-acetát (1: :1:1:1) fy : 0,64 Nagynyomású folyadékkromatográfia (HPLC) C-18 oszlop a) izokratikus elúció eluens: víz-acetonitril-TFA (60:40:0,25) K’ : 4,29 b) gradiens elúció eluens: víz-acetonitril-TFA (80:20:0,25— 50:50:0,25), 10 percen át, majd viszsza az eredeti értékre K’ : 6,9 Gyors atomokkal való bombázás (FAB)(M+H)+ 1039-nél. 3. példa Pmp(4-MeBzl )-D-Tyr(Et)-Phe-Y - Asn - -Cys(4-MeBzl-)-Arg(Tos)-BHA-gyanta szilárd fázisú szintézise Kiindulási anyagként 1,34 mmól/g gyanta Boc-Arg(Tos) -BHA-gyantát használunk a cím szerinti, gyantához kötött pepiid előállítására. A kiindulási anyagot úgy állítjuk elő, hogy 3 mmól Boc-Arg(Tos)-t 1,0 mmól benzhidril-amin-gyantával reagáltatunk két órán át, dimetil-formamidban. A szabad bázis formában lévő benzihidril-amin gyantát egy éjszakán át metilén-kloridban duzzasztjuk. Ezután 7%-os metilén-kloridos. diizopropil-etil-amin- 6 9-oldattal (DIEA) egyszer, metilén-kloriddal hatszor, és végül vízmentes dimetil-formamiddal kétszer egy percen át mossuk. A Boc-Arg(Tos) gyantához való kapcsolását rázatás közben végezzük, 6 mmól 1-hidroxi-benztriazol (HBT) és 3 mmól diciklohexil-karbodiimidet használva. A kapcsolás után a szokásos módon ninhídrin-reakcióval és aminosav-analízissel határozzuk meg a gyanta %-os terhelését. A gyanta terhelése ezesetben 53%, csak 0,709 mmól/g gyanta terhelés érhető el. A Boc-Arg(Tos)-gyantához ezután szekvenciálisán kapcsoljuk a megfelelően védett aminosavakat, Beckman 990 B peptid-szintetizátorban. A kapcsolást — a Boc-Asn és Pmp(4-MeBzl) kivételével — minden esetben az alábbiak szerint végezzük. 1) Metilén-kloridos mosás (háromszor 1 perc); 2) 50%-os metilén-kloridos trifluor-ecetsavval előmosás (egyszer 1 perc); 3) Védőcsoport eltávolítása 50%-os metilén-kloridos TFA-oldattal (30 perc); 4) Metilén - kloridos mosás (háromszor 1 perc); 5) Előmosás 7%-os metilén-kloridos DIEA-oldattal (egyszer 1 perc); 6) 7%-os metilén-kloridos DIEA-oldattal semlegesítés (egyszer 10 perc); 7) Metilén - kloridos mosás (háromszor 1 perc); 8) Hozzáadunk 3 mmól védett aminosavat metilén-kloridban, majd 3 mmól DCC-t 10 ml 0,3 mól/l koncentrációjú metilén-kloridos oldatban, és 2 órán át lejátszatjuk a kapcsolási reakciót; 9) Metilén - kloridos mosás (háromszor 1 perc); 10) Mosás 1:1 arányú etanol-metilén-klorid eleggyel (háromszor 1 perc); 11) Metilén - kloridos mosás (háromszor 1 perc). Az Asn-aminosavmaradék hozzákapcsolását 6 mmól 1-hidroxi-benzotriazollal (HOBT) végezzük, 10 ml 0,6 mmól/1 koncentrációjú dimetil-formamidos oldatban. Oldószerként vízmentes dimetil-formamidot használunk a Pmp(4-MeBzl) gyantán lévő peptidlánchoz kapcsolása esetén is, 3 mmól 4-dimetil-amino-piridin (DAP) alkalmazásával. A kapcsolási reakciók lefolyását minden esetben ninhidrin-reakcióval követjük. A Cys és a pentametilén-merkapto-propionsav (Pmp) merkaptocsoportját p-metil-benzil-csoporttal védjük. Az Asn aminosav-egység hozzákapcsolása után a gyantához kötött pepiidet két, 0,355 mmól-os egységre hasítjuk, amelyekbe egymástól elkülönítetten beépítjük a Boc-Abu-t, illetve Boc-Val-t a 4-es helyzetben, majd a szekvenciát a fent jelzett módon a Pmp féle folytatjuk. A kapott védett peptid-gyanta köztitermékeket — azaz a [Pmp(4-MeBzi)-D-Tyr(et)-Phe-Y-Asn-Cys(4-MeBzl) -Arg(Tos) - -BHA-gyantá]-t, ahol Y jelentése Abu vagy Val — kiilön-külön metilénTkloriddal mossuk 10 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
