197927. lajstromszámú szabadalom • Eljárás opiát receptor specifikus affinitás-jelölő omega-halogén-metil-tetrapeptid-származék előállítására
197927 1 körüli érték, vagy kisebb, agonistákra pedig 1-nél jóval nagyobb. Meghatároztuk a DAMK és néhány referencia opiát ligand 1C50 értékét mind Na+ mentes közegben, mind 100 mM Na+ jelenlétében. A Na+ index alapján a DAMK agonista karakterűnek mutatkozott (I. táblázat). b) Nagy affinitású kötődés összehasonlítottuk a DAMK in vitro rendszerben meghatározott affinitási konstansait (IC50) ismert opiátok és az „anyavegyület“, a DAGO affinitásaival. Méréseinkben opiát agonistát (3H-dihidromoríin) és antagonistát (3H-naloxon) használtunk. Eredményeinket a 11. táblázatban foglaltuk össze. Megállapítottuk, hogy — a DAMK affinitása az opioid receptorokhoz nagy, nanomólos nagyságrendű, összevethető az alkaloidák (morfin) in vitro hatáserősségével, — nem különbözik szignifikánsan a DAGO affinitástól (tehát a klórmetil keton csoport nem „rontotta el“ a molekula hatását. c) mu szelektivitás A II. táblázat 3H-dihidromorfinnal mért adatai igazolják a DAMK nagy affinitását a morfin kötőhelyekhez (u altípus). Meghatároztuk és összehasonlítottuk a DAMK affinitását ismert opiát ligandok és opioid peptidek affinitását a delta receptor altípusra (3H-DALE kötés) és a kappa altípusra (3H-EKC kötés) is. A kereszt reakciók csökkentésére szelektív gátlószereket alkalmaztunk (Br. J. Pharm. 73, 939, 1981) szerint. Eredményeinket a III. táblázat tartalmazza. A mu szelektivitást jellemző érték, az ún. mu/delta arány alapján a DAMK a morfin és a DAGO (mu agonista prototípusok) szelektivitásával vetekszik, tehát elsősorban a mu receptorokhoz kötődik. A DAMK affinitása a kappa és delta receptorokhoz gyenge. d) A DAMK kötődésének irreverzibilitása A DAMK irreverzibilis kötődését a patkány agyi membránpreparátumhoz előinkubálásos-kimosásos módszerrel (Life Sei. 32, 2777, 1983) határoztuk meg. A vizsgálat során a membránpreparátumot DAMK jelenlétében szobahőmérsékleten 1,5 h-ig inkubáltuk, majd az inkubációs elegyet jéghideg pufferrel 10- szeresére hígítottuk, és disszociáltatás után 25000 g-vel leülepítettük. Az üledéket kb. 30-szoros térfogatú friss pufferrel felszuszpendáltuk és 15 perces inkubálás után újra centrifugáltuk. E kimosásos lépést, mely során a szabad, ill. a reverzibilis kötött ligandtól megszabadulunk, 4-szer megismételtük. A végső üledéket felszuszpendálás után különféle jelzett opiát ligandokkal együtt inkubálva a receptorkötést (maradék opiát aktivitást) a szokásos módon meghatároztuk és a minták fehérje tartalma alapján korrigáltuk. Kontrollként a pufferrel, vagy valamilyen reverzibilis opiát liganddal (pl. a szubsztrát analóg DAGO-val) előinkubált membránt használtuk A reverzibilis ligandok a fenti módszerrel 6 9 tökéletesen kimoshatok a rendszerből, a kontroll specifikus kötés jól reprodukálható velük. Az első ábrán a DAMK irreverzibilitásának koncentráció függését mutatjuk be. 0,1 — 100 pM DAMK előinkubálás után a membránpreparátumot extenzíven mostuk, és a maradék aktivitását 3H-naloxon segítségével határoztuk meg. A DAMK koncentráció függő módon gátolta a 3H-naloxon kötődését. A DAGO (10 pM) a kontroll (C) értéket adta vissza. Nem opioid klórmetil ketonok (TPCK és TLCK) nagy koncentrációban sem okoznak irreverzibilis gátlást, tehát a klórmetil keton csoport önmagában nem hatáshordozó. Ha a DAMK-kal előkezelt membránok kimosás utáni maradék opiát receptor aktivitását altípus specifikus (3H-DALE=delta, 3H-dihidromorfin=mu) radioligandokkal mértük, a 2. ábrán feltüntetett eredményeket kaptuk. A DAMK koncentráció függő módon gátolja mind a delta, mind a mu ligandok kötődését, a hatás a mü receptorokon nagyobb, de a delta receptoron sem hanyagolható el. A 3. ábrán a DAMK előkezelés hatását mutatjuk be a (kimosott) membránok 3H-naloxon kötésének koncentráció-függésére. Az agyi membránpreparátumot 10, pM DAMK- kal, ill. pufferrel, a kontroll esetben a szokásos módon előinkubáltuk, majd a reverzibilisen kötődött és a feleslegben lévő ligandot eltávolítoituk. Meghatároztuk a membránok 3H-naloxcn kötésének koncentráció-függését (0,1 — 25 nM 3H-naloxon koncentráció tarományban) A 3. ábrán a telítési görbék Scatchard szerinti ábrázolását mutatjuk be. A kontroll mintákon (o-c ) (Pufferes előkezelés) a pontok hiperbolára illeszkednek, amely felbontható a nagy és kis affinitású, 3H-naloxon kötőhelyeknek megfelelő komponensekre. A DAMK előkezelés után (x-x) a nagy affinitású kötőhely elirrinálódik, hiperbola helyett a pontok egyenest határoznak meg, vagyis a DAMK elsősorban a nagy affinitású (mu-1) kötőhelyekre hat irreverzibilisen. A mu-1 kötőhelyet egyébkénl az analgézia közvetítésével hozzák kapcsolatba. A továbbiakban a DAMK irreverzibilis kötődésének altípus specifitását vizsgáltuk. 10 xM DAMK-kal előkezelt (és kontroll) membrán mintákkal felvettük a mű (3H-DAGO), kappa (3H-EKC) és delta (3H-DADLE) receptor altípusok adekvát telítési görbéit. A 4. ábrán a telítési görbék Scatchard transzformációja látható (o-o kontroll membránok x-x 10 pM DAMK előkezelés). A kappa és a delta receptor esetében a pontok lényegében azonos görbék mentén szórnak, tehát különbséget nem mutatnak. Ezzel szemben a 3H-DAGO (mű receptor) kötődését a DAMK szignifikánsan gátolja. Az 5. ábrán 1 pM DAMK előkezelés hatását láthatjuk a mű (3H-dihidromorfin) és a delta (3H DALE) receptorra. Az előző ábrához hasonló módon a delta receptoron nem kapunk 10 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
