197926. lajstromszámú szabadalom • Eljárás glikopeptid antibiotikumok kinyerésére
197926 mázott szívatással vákuumban tartottunk. Az átlagos áramlási sebesség 100 ml/cm2/óra. A kimerült fermentlé (170 liter) a kiindulási teikoplanin aktivitás kevesebb, mint 5%-át és a fermentlé polárisabb komponenseinek (nem-kívánatos szilárd anyagok és színes szerves anyagok) több, mint 80%-át tartalmazza. 50 liter ionmentesített vízzel való mosás után a gyantát 50 liter 9:1 (téri./ /téri.) metanoLvíz eleggyel eluáljuk, amely nátriumkarbonátot (0,3—1,0 g/liter, grádiens) tartalmaz. 5X10—10 literes eluátum-frakciót fogunk el. Az egyes frakciókat vizes ásványi savval pH 7-re semlegesítjük és HPLC elemzésnek vetjük alá. Csak két eluátum-frakciót, amelyek az antibiotikum több, mint 90%-át tartalmazzák, egyesítünk (20 liter) és a kapott oldatot csökkentett nyomáson, 45—50°C-on 3,3 liter vizes maradék szuszpenzióvá töményítjük be. Ehhez a tömény teikoplanin szuszpenzióhoz kevertetés közben 13,2 liter acetont adunk. A csapadékot szobahőmérsékleten 3 órán át állni hagyjuk és a tiszta felülúszó acetont dekantáljuk. A szilárd anyagot szűréssel különítjük el, a szűrőlepényt szobahőmérsékleten acetonnal feliszapoljuk. A terméket ismét szűrjük és egy éjjelen át vákuumban, szobahőmérsékleten szárítjuk. HPLC-vel elemezve 85,7% tisztaságú teikoplanint kapunk; kitermelés 81,9% a fermentlében jelenlevő, mikrobiológiai úton meghatározott kiindulási aktivitásra vonatkoztatva. Víz- és oldószertartalom: 11,5 tömeg%, szervetlen maradék: 2,8 tömeg%. A 16,5 I térfogatú anyaglúg a kiindulási teikoplanin mennyiség kb. 2%-át tartalmazza. A gyanta adszorpciós hatásfokát előzetesen a következő eljárással határozzuk meg. 360 ml tömény oldatot (amely 3,1 g/i nyers teikoplanint tartalmaz) 50 ml-es részletekben felviszünk egy oszlopra, amelyet 15 g (60 ml) nedves Polyamido-CC 6 gyantával töltöttünk meg. A gyantát 50 ml 9:1 térf./térf. arányú metanol/víz eleggyel eluáljuk, az eluátum minden 50 ml-es részletét HPLC-vel elemezzük, a teikoplanin tartalom meghatározására 250 ml oldatot vezettünk át az oszlopon és az eluált oldatban nem figyeltünk meg teikoplanint. A következő részlet kb. 0,7 g/ml antibiotikumot tartalmazott. Ezt úgy értelmeztük, hogy 0,9 g teikoplanin telítette a 15 g gyantát. Ez az érték 67 1 /kg teikoplanin Polyamido-CC 6 gyanta/kg antibiotikumnak felel meg. A teikoplanin fizikai-kémiai jellemzői 1) Ultraibolya spektrum, különböző pH- jú vizes oldatban felvéve: W=278 (0,1 N HCI) Xmax=297 (0,1 N NaOH) 2) A teikoplanin végtermék fő adszorpciós sávjának vizsgálata 9 6 10 Infravörös spektrum Sávok (v, cm ) Jellemzők 3250 glikozid vOH 1645 amid I 1610 vCOO-1590 6NH3+ 1510 amid II 1295 amid III 1230 glikozid ŐOH, vC-O 1140, 1060, 1025 glikozid vC-0 3) Metil-celloszolv (MSC) és víz 4:1 arányú elegyben oldott termék 0,1 N NaOH-dal való titrálása, miután 2,3 ekvivalens menynyiségü 0,1 N sósavat adtunk hozzá, pK]=5 és pK2=7,l értékeket és pH 9 és 12,5 között, jól definiálható végpont nélküli folyamatos titrálási görbét mutatott. 4) Elemanalízis: C 48,03 t% N 5,54 t% Na 1,64 t% H 5,66 t% Cl 3,68 t% 2. példa A következő kísérleteket szűrt fermentlevekkel végeztük, amelyeket úgy állítottunk elő, hogy a fermentációs táptalajhoz a teikoplanin A2 faktor egyes komponenseinek megfelelő prekurzorait adagoltuk, a 851 2795 sz. nagy-britanniai szabadalmi leírásban foglaltak szerint. Adszorbens mátrixként ugyanolyan típusú Polyamide-CC 6 gyantát használtunk, mint az 1. példában. 60 liter, a micéliumtól megszabadított fermentlevet felviszünk egy oszlopra, amely 84 liter/kg aktivitás mennyiségű gyantát tartalmaz. Ionmentesített vízzel való mosás után az aktivitást az 1. példa szerinti eljárással eluáljuk és kicsapjuk. 77%-os kitermeléssel 86% (HPLC) tisztaságú teikoplanint nyerünk ki (víz- és oldószer-tartalom 9,1%; szervetlen maradék 4,7%). 3. példa 300 liter szűrt teikoplanin tartalmú fermentlevet — amelyet úgy állítottunk elő, hogy a fermentációs közeghez a 8512795 sz. nagy-britanniai szabadalmi leírás szerint L-valint adagoltunk — pH 6-on átvezetünk egy 19X XI00 cm-es üvegoszlopon, amely 25 liter Polyamide-SC 6-ot (amelynek részecskeméretét és más jellemzőit az előzőekben írtuk le) tartalmaz. A kimerült fermentlé egyáltalán nem tartalmaz teikoplanint. A gyantát 50 liter ionmentesített vízzel mossuk, majd 50 liter 0,05 M (pH 8) vizes nátrium-acetáttal mossuk az oszlopot. A kiindulási fermentlében jelenlevő szilárd szennyezés több, mint 90%-a eltávolítható ily módon. Az antibiotikumot ezután 50 liter 40:60 aceton:víz elegygyel eluáljuk, amelyet ecetsavval pH 4-re állítottunk be. A hasznos frakciókat, amelyek a kiindulási antibiotikum 85%-át tartalmazzák, összeöntjük (30 liter). Csökkentett nyomáson, pH 6,5—7-en végzett betöményítés-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
