197772. lajstromszámú szabadalom • Mikrobiológiai eljárás új, streptogramin-típusú antibiotikumok és ezeket tartalmazó takarmányadalékok előállítáásra
197772 rint a Streptomyces DSM 3640 törzset vagy e törzs természetes vagy mesterséges variánsait és mutánsait 6,5 és 8,5 közötti pH érték mellett 20—40°C-on aerob körülmények között szén- és nitrogénforrásokat, szervetlen sókat és nyomelemeket tartalmazó tápközegben fermentáljuk, majd a vegyületeket ismert módon a tenyészléből elkülönítjük. Az új antibiotikumok előállításához használt tápközeg szénforrása glükóz, keményítő, dextrin, glicerin, szacharóz, melasz vagy olaj lehet, nitrogénforrásként például szójaliszt, élesztőkivonat, húsleves, malátakivonat, kukoricalekvár, pepton vagy kazein jöhet számításba. Szervetlen tápközegként nátrium-kloridot, magnézium-szulfátot, ammónium-szulfátot és kalcium-karbonátot, nyomelemként vas-, mangán-, réz-, cink- és kobaltsókat adagolhatunk. A Streptomyces sp. DSM 3640 törzset előnyösen 25--30°C-on és 6,5—7,0 pH érték mellett tenyésztjük. A fermentálást előnyösen a 40 -50. óra után szakítjuk meg, mert ilyenkor a kívánt vegyületek hozama a legmagasabb. A fermentálást előnyösen süllyesztett tenyészetben végezzük. A fermentálás lefolyását és a streptogramin vegyületek képződését úgy követhetjük, hogy a tenyészlé és a micélium Staphylococcus aureus 209 P-re kifejtett antibakteriális hatását figyeljük. A Streptomyces DSM 3640 fermentálása során főleg IV-neoviridogrizein, emellett I-, 11- és 111-grividomicin és II-neoviridogrizein, valamint adott esetben I- és III-neoviridogrizein képződik. Az egyes antibiotikumok részaránya a tápközeg összetételétől függően széles tartományon belül változhat. Általában az elkülönített fermentációs termék mintegy 90% vagy ennél több IV-NVG-t tartalmaz, a többi alkotó együttesen nem tesznek ki 10%-nál többet. A fermentálás termékeit elegy formájában hagyományos módszerekkel, például vízzel nem elegyedő oldószerrel végzett extrahálás útján különítjük el, oldószerként kloroformot, diklór-metánt, n-butanolt, etil-acetátot alkalmazhatunk. Az etil-acetátot előnyben részesítjük. Az I-, II- és III g rividomicint kromatográfiai rutin módszerekkel választhatjuk el az I-, II-, III- és 9 IV-neoviridogrizeinek és a grizeoviridin mellől- Az ilyen módszerek például: gravitációs, közepes nyomású oszlopkromatográfia Kieselgélen Sephadex(R)-LH-20-kromatográfia, alkalmas 5 oldószereleggyel végzett ellenáramú csepp-kromatográfia, preparatív nagyteljesítményű folyadékkromatográfia LiChrosorb(K J-RP-18 adszorbensen vagy vékonyréteg-kromatográfia. 10 A micéliumból az antibiotikumokat szerves oldószerrel, előnyösen acetonnal extrahálva nyerhetjük ki. Az acetonos extraktumot betöményítjük, a vizes fázis pH-ját 4,5 és 7,5 közötti, előnyösen 6,5 értékre állítjuk, lg és a vizes részt vízzel nem elegyedő oldószerrel, így kloroformmal, diklór-metánnal, n-butanolt, etil-acetáttal vagy butil-acetáttal, előnyösen etil-acetáttal extraháljuk. A micéliumból nyert etil-acetátos . extraktumot kü- 20 lön dolgozhatjuk fel, de egyesíthetjük a tenyészlé szürletével is. Az I-, II- és III-grividomicinek színtelen, amorf porszerű termékek, oldhatók az alábbi oldószerekben: metanol, etanol, n-propa- 25 nol, izopropanol, n-butanol, etil-acetát, n-butil-acetát, aceton, etil-metil-keton, benzol, toluol-, diklór-metán, kloroform, dimetil-formamid és dimetil-szulfoxid; nehezen oldódók vagy oldhatatlanok az alábbi oldószerekben: 2q hexán, petroléter (40—60), dietil-éter és víz. Olvadáspontjaik az alábbiak: I- grividomicin 141 — 145°C II- grividomicin 153 -157°C III- grividomicin 197—198°C 3g A három grividomicin móltömege 864. A csatolt rajzok a vegyületek spektroszkópiai adatait mutatják az alábbi sorrendben: 2. ábra: III-grividomicin KBr-ban felvett IR-színképe, 40 3. ábra: III-grividomicin tömegspektruma, 4. ábra: II-grividomicin KBr-ban felvett IR-színképe, 5. ábra: II-grividomicin tömegspektruma, 6. ábra: I-grividomicin KBr-ban felvett IR-színképe, 45 7. ábra: I-grividomicin tömegspektruma. Készen vett Kieselgél-lemezzel végzett vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálat az alábbi R,-értéket adja: 10 R f R f metanol kloroformban 3 \ 7,5 \ metanol etilacetátban 5 % 10 % III-grividomicin 0,18 0,4] 0,15 0,25 II-grividomicin 0,23 0,46 0,32 0,34 I-grividomicin 0,29 0,55 0,28 0,40 6
