197771. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az A 40926 antibiotikum komplex egyes fő komponensei arányának szelektív növelésére
197771 a közeghez, akkor a pH-t vagy a közeg pufferolásával szabályozzuk, vagy pedig úgy, hogy azonnal semlegesítjük a mikroorganizmusokra nézve nem toxikus bázisokkal. Ha a prekurzor aminosav, akkor olyan bázisokkal képzett sóinak vizes oldata alakjában adhatjuk hozzá a közeghez, melyek a termelő mikroorganizmusokra nézve nem toxikusak (pl. nátriumsók), de sok esetben az aminosavat egyszerűen „belső só”-jának oldataként is alkalmazhatjuk. Prekurzorként mind a racém keverékek, mind pedig az optikailag aktív izomerek felhasználhatók, de az L-alak általában nagyobb kihozatalt eredményez, mint a megfelelő D-alak. Ezért a találmány egyik előnyös megvalósításában az A 40926 antibiotikum komplexben a Bo vagy PB, vagy az A vagy PA faktor koncentrációjának növelését az aminosav prekurzor — mely az előbbi esetben valin vagy annak valamely sója vagy észtere, az utóbbiban pedig izoleucin vagy annak valamely sója vagy észtere — L-alakjának alkalmazásával végezzük. A találmány ezen előnyös megvalósításában az A vagy Bo faktor aránya a fermentációs termékben a 80%-ot is meghaladhatja. A kis szénatomszámú alkánkarbonsav prekurzorokat (2-metil-vajsav, izovajsav, alfa-keto-izovaleriánsav, alfa-keto-béta-metil-valeriánsav) nem toxikus bázisokkal képzett sóik vizes oldata alakjában alkalmazhatjuk; általában előnyösek az ammonium- és a nátriumsók. Ha a fenti kis szénatomszámú alkánkarbonsavaknak vagy telítetlen zsírsavaknak kis szénatomszámú monohidroxi-alkanol okkal képzett észtereit használjuk prekurzorként, ezek rendszerint metanol-, etanol- vagy propanol-származékok, de 4—6 szénatomszámú alkanolokkal képzett észtereket is alkalmazhatunk, Ez esetben az alkanol nem lehet azonos azzal, ami a másik faktor prekurzoraként működhet (izobutanol, 2-metilbutanol vagy propanol). Az alkanol prekurzorokat (mint pl. izobutanoi, 2-metilbutanol vagy n-propanol) általában eredeti alakjukban adjuk a fermentációs közeghez, de használhatók a mikroorganizmusokra nem toxikus savakkal képzett észtereik alakjában is. Ezek a savak nem lehetnek azonosak azokkal, amelyek az A 40926 másik faktorának prekurzoraként működnek. Általában előnyösen alkalmazhatók a 2—4 szénatomszámú lineáris alkánkarbonsavakkal (pl. ecetsav, propionsav, vajsav) képzett észterek. A fermentációs közeghez adható „szelektive hatásos mennyiség” függ a prekurzor típusától. A kis szénatomszámú alkánkarbonsavak (izovajsav, 2-metil-vajsav) észtereiből olyan mennyiséget alkalmazunk, hogy a fermentációs közegben a sav koncentrációja 0,1 — 5 g/1, előnyösen 0,1 — 1 g/1 legyen. A kis szénatomszámú alkanolokból (izobutanol, 2-metil-butanol, n-propanol) vagy a mikroorganiz5 musokra nem toxikus savakkal képzett észtereikből olyan mennyiséget alkalmazunk, mely a közegben 0,5—5 g/1, előnyösen 1 — 2 g/1 koncentrációt eredményez. Az aminosavakból (valin, izoleucin) és a keto-savakból (alfa-keto-izovaleriánsav, alfa-keto-béía-metil-valeriánsav) és bázisokkal képzett sóikból a „szelektive hatásos mennyiség” 0,2—5 g/1, előnyösen 0,5—4 g/1, a legelőnyösebben 2—4 g/1. Ha a kis szénatomszámú alkánkarbonsavakat (mint pl. ízovaleriánsav, izovajsav) vagy sóikat közvetlenül adjuk a fermentációs közeghez, a „szelektive hatásos mennyiség" 0,1—2,5 g/1, előnyösen 0,3—1,5 g/1. A fent megadottaknál nagyobb koncentrációk hatásosak lehetnek az A 40926 egyes faktorainak %-os növelésében, de a tenyészetre kifejtett toxikus hatás következtében a teljes kihozatal általában csökken. 1. Példa Rézsútos felületű zabliszt-agar táptalajon tenyésztett Actinomadura sp. ATCC 39727 törzzsel beoltottunk 500 ml-es lombikot, mely 100 ml-t tartalmaz az alábbi összetételű közegből: 6 Húskivonat 5 g Autolizált élesztő 5 g Pepton 5 g Hidrolizált kazein 3 g Glükóz 20 g Nátrium-klorid l,5g Kalcium-karbonát 4 g Desztillált víz szükség szerinti mennyiség A palackot 28°C-os hőmérsékleten 72 órára 200/perc fordulatszámú forgó rázógépbe helyeztük, majd a micéliumot lecentrifugáltuk, steril, deionizált vízzel kétszer átmostuk, és 100 ml steril, ionmentesített vízben szuszpendáltuk. E szuszpenzió 2 ml-es mennyiségével beoltottunk egy, a fenti összetételű közegből 100 ml-t tartalmazó 500 ml-es Erlenmeyer-lombikot, hozzáadtuk a megfelelő prekurzort és 28—30°C hőmérsékleten tartottuk. Az antibiotikum termelését a papírlemezes agar-diffuziós módszerrel követtük, vizsgáló organizmusként B. subtilis törzset használtunk. A 200/perc fordulatszámú forgó rázógépben végzett 72 órás tenyésztés után a fermentiszapot egy Sepharose-Epsilon-aminokaproil-D-alanil-D-alanin oszlopon leszűrtük (ehhez 0,3 ml fermentlére számítva 0,3 ml gyantát használtunk), majd 1 tömeg/térfogat%-os ammóniumhidroxid-oldattal eluáltuk. Az A 40926 antibiotikumot tartalmazó frakciókat összegyűjtöttük, és 1 napon át szobahőmérsékleten állni hagytuk, majd az alábbiakban leírt eljárás szerint nagynyomású folyadékkromatográfiás módszerrel elemeztük: oszlop: Ultrasphere ODS (5 mikrométer) sz'ilánozott szilikagél Altex (Beckman), belső átmérő 4,6 mm X 250 mm; 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
