197767. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán relaxint kódoló gén-szekvencia molekuláris klónozása és jellemzésese, valamint humán H2 relaxin előállítására
197767 22 re! kombináljuk, amelyet Chance és Hoffmann Írtak le a 68844/81 sz. ausztrál bejelentésben az inzulin láncokhoz, ahol az S-szulfonált peptideket A:B 2,6:1 arányban keverték 10 mg/ml peptid-koncentrációnál, 10,5 pH-jú glicin pufferban. Glicin pufferban levő ditiotreitolt adunk ez után olyan mennyiségben, hogy összesen 1,0 merkapto-csoport jusson minden egyes S-szulfo-csoportra. A reakciókeveréket ez után nyitott edényben 24 órán át kevertetjük. Ennek az eljárásnak további módosításaként arra jöttünk rá, hogy a biológiailag aktív relaxin képződéséhez vezető lánc-kombinációs reakciót úgy lehet hatásosan végrehajtani, ha egyik vagy előnyösen mindkét peptid-láncot S-tio-etil-Cys származékként alkalmazzuk az S-szulfo-származék helyett, amelyet Chance és Hoffmann (lásd fentebb) inzulin esetében előírtak. Az S-tio-etil-Cys peptidek alkalmazásával kiküszöbölünk egy reakciót és egy tisztítási lépést, amely a peptideknek az S-szulfo származékká történő átalakításához szükséges. Tapasztalataink szerint a relaxin peptidek S-szulfonálási reakciója mellékreakciókkal együtt megy végbe, amelyek nehézzé teszik az S-szulfo-peptidek tisztítását, ez pedig alacsony kitermeléshez vezet. A fenti körülményeket alkalmazva a lánc-kombinációban 1,5—6% kitermelést érünk el, Wiquist és Paul (Acta Endocrinol. 29, 135— 136 (1958)) patkány méh összehúzódásban jelentkező biológiai aktivitás-vizsgálatának módszerével mérve. Példa a lánc-kombináció reakcióra Humán relaxin H2 [S-tio-etil Cys10’11’15] A(1—24)-et (4,2 mg száraz súly, 2,4 mg (0,84 pmó!) pepiid aminosavanalízis alapján (feloldunk 500 pl 0,1 mól/literes glicinpufferban (pH 10,5), egy 3 ml-es, dugóval ellátott műanyag centrifuga csőben. 200 pl 0,1 mól/literes glicin pufferban (pH 10,5) oldott humán relaxin H2 [S-szulfo-Cys10’11) B (-1—24)-et (1,60 mg, 1,60 mg pepiid tartalom (0,33 pmól) az aminosav-analízis alapján) adunk hozzá, és a keveréket keverjük. 0,1 mól/literes glicin-pufferban (pH 10,5) készített ditiotreitol (DTT) törzsoldat (0,96 pmól DTT 10 pl-ben) egy alikvot részét (23,0 pl (2,21 pmól) DTTJ adjuk hozzá a pepiid oldathoz, és rövid keverés után a reakciókeveréket 4°C hőmérsékleten 24 órán át állni hagyjuk nyílt levegőn. A keveréket ez után centrifugáljuk és a felülúszó oldat egy alikvotját relaxin biológiai aktivitásra mérjük patkány-méh összehúzódási vizsgálattal. A reakciókeverék alikvotjai gátolják a patkány-méh spontán összehúzódását dózis-függő módon. Egy 75 pl-es alikvot, amely teljesen meggátolja a méhösszehúzódást, ekvivalens egy 5,3%-os lánc-kombinációs kitermeléssel, amint ez a természetes sertés relaxin standarddal (A 22 B 31) összehasonlítható. 21 Autentikus humán relaxin (H2: hRLX A(l—24) — B(-l— 32) szintézise 1. ) A teljes hosszúságú H2 humán relaxin -1 —(-32 gyökeinek megfelelő aminosav-szekvenciát a fentebb leírt módszerrel szintetizáljuk, 6,4 g N-a-tercier-butil-oxi-karbonil-L-leucin-fenil-acetil-amino-metil polisztirol gyantával kezdve, 0,23 Leu/g terheléssel. Az A(1—24) és B(-l—24) peptidekhez használt oldallánc-védő csoportokat alkalmaztuk itt is a teljes hosszúságú B-lánchoz, beleértve az S-etilmerkapto-származékokat is mindkét ciszteinhez (a 10. és 22. helynél). Ennek a stratégiának egy módosítása volt a BOC-L-triptofán N-formil származékának az alkalmazása a 27. és 2. helyeknél levő kapcsolásokhoz. A láncegyesítést követően a peptid-tartalmú gyanta végső mennyisége 8,2 g. A peptid-gyanta egy részét (4,0 g) vízmentes hidrogénfluorid-anizol keverékkel kezeljük, ahogyan ezt korábbi példáinkban leírtunk, és 1,5 g nyers [S-tio-etil Cys10’22, N-formil Trp2’27] hRLX B (-1 —32)-t nyerünk. A nyers pepiidet Bio Gel P 6-on gél-szűrésnek vetjük alá 0,1 mól/liter ecetsav-oldatban. A gél-szűrő oszlopról eluált főcsúcsokat aminosav-analízissel jellemezzük. Az analízis alapján a -1 — -(-32 peptid-szekvenciával megegyező frakciókat összegyűjtjük és liofilezzük. A triptofán-gyökök formil-mentesítését a peptid (100 mg) 5 ml pH 11,5-ös, nátrium-hidroxid oldattal történő 5 perces kezelésével végezzük, amely idő alatt a peptid kicsapódik az oldatból. A reakciókeveréket semlegesítjük a peptid feloldása érdekében, és közvetlenül BioGel P 6 oszlopra visszük fel 0,1 mól/literes ecetsav-oldatban. A formilcsoport eltávolítását a triptofánról UV spektroszkópiával figyeljük, követve az N-formil abszorpció eltűnését 300 nm-nél és a jellegzetes triptofán-spektrum megjelenését egy 280 nm-nél mért abszorpciós maximumnál. Az oszlopról lejövő, korrekt aminosav-analízist mutató frakciókat összegyűjtjük és liofilezzük. Az [S-tio-etil-Cys10’22] hRLX B (-1—32) peptid további tisztaságnövelésére végzett kísérletek preparatív HPLC-vel nem voltak sikeresek a peptid-veszteség miatt az oszlop közegében történő adszorpció következtében. A gél-kromatográfiával tisztított peptideket közvetlenül használjuk a. lánc-kombinációs kísérletekben. 2. ) Az A(1—24) lánc-kombinációja B(-l — 32)vel; a humán relaxin H2 készítése A szintetikus S-szulfonált és S-tio-etii H2 humán relaxin A(1—24) peptideket összekapcsoljuk S-tio-etil H2 humán relaxin B(-1 — 32)vel, ugyanazt a lánckombinációs eljárást alkalmazva, amelyet korábban már leírtunk a rövidített B lánchoz (-1—24). A rekombinációs keverék mintáit relaxin biológiai aktivitásra vizsgáljuk patkány-méh összehúzódási vizsgálattal. A reakciókeverék alikvotjai gátolják a patkány-méh spontán össze5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 12
