197732. lajstromszámú szabadalom • Eljárás naftotiazepinon származékok és az azokat tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
197732 elő. (Ill) általános képletű vegyületként pl. az alábbi haiogenidek alkalmazhatók: 2- (dimet il-amino) -etil-klór id; 2- (dimetil-amino) -etil-bromid; 2- (dietil-amino) -etil-klórid; 2- (dipropil-amino) -etil-klorid és 3- (dimetil-amino) -propil-klorid. Az (I) általános képletű vegyületek és gyógyászatilag alkalmas savaddíciós sóik ka 1 - ciumantagonisták — közelébbről kalciumcsatorna-blokkolók — és ezért iskémia kezelésére és vérnyomáscsökkentésre alkalmazhatók. Ezenkívül az (I) általános képletű vegyületek bizonyos esetekben az alábbi AtPase-teszt szerint kalmodulin-antagonista aktivitást mutatnak; ez szintén kedvező hatás. Az (I) általános képletű vegyületek hasznos farmakológiai hatásait melegvérű állatokon az alábbi standard módszerekkel határozzuk meg. Vérnyomáscsökkentés spontás hipertenzív patkányon Minden teszthez 6—6 hím SH patkányt alkalmazunk. Az állatok testsúlyát feljegyezzük. Nem érzéstelenített és befogva tartott patkányok farkán a szisztólás vérnyomást (Hgmm) mérjük (a gyógyszer beadása előtt 6 kontroll meghatározást végzünk). A patkányokat előzetesen 5—10 percen át 32—34°C- on melegítjük. A szisztólás vérnyomást elzárásos karmantyúval mérjük. A teszt-vegyületet a patkányoknak orálisan adjuk be 5% teszt-vegyületet tartalmazó akácia-gumi-készítmény formájában. A patkányok vérnyomását a teszt-vegyület orális beadása után órákon át mérjük. A teszt-vegyület vérnyomáscsökkentő hatása jelzi az antihipertenzív hatóanyagként való alkalmasságot. A kapott eredményeket az I. táblázat tartalmazza. Tengerimalac-ileum assay — tónikus kontrakció 300—400 g testsúlyú hím tengerimalacokat elkábítunk és elvéreztetünk. Az állatok hasát felnyitjuk és a terminális ileumból 10— 15 cm-t óvatosan eltávolítunk, megtisztítunk és alábbi összetételű Tyrode-oldatba helyezünk: NaCl (8 g/l), KCI (0,2 g/1), MgCl2 (0,2 g/l), CaCI2 (0,2 g/l), NaH2P04 (0,05 g/ /1), NaHC03 (1,0 g/l) és glükóz (1 g/l). Az oldatot 37°C-on tartjuk és 95% oxigénből és 5% szén-dioxidból álló gáz alá helyezzük. Ileumdarabokat üvegbotra helyezünk és a külső longitudinális izomrétegen levő mezenterikus csatlakozás hosszában lapos vágást ejtünk. A hosszanti izmot az alatta levő köralakú izomtól enyhe vágással elválasztjuk [Rang, H.P.: Annals of N.Y. Academy of Sciense Vol. 144 576 (1964)]. A szövetet egyik végén a szövettartóhoz rögzítjük, míg másik végét fonál segítségével erő-transzducerrel kötjük össze és 37°C-on tartott, 95% 6 9 oxigénből és 5% szén-dioxidból álló gáz alá helyezett Tyrode-oldatban felfüggesztjük. Kezdetben 500 mg-os feszítést alkalmazunk és a szövetet az értékelés megkezdése előtt 60 percig egyensúlyra hagyjuk beállni. Ebben az időszakban 16 percenként megmossuk. Minden készítményt 16 perces időközökben 2 percen át annyi kálium-kloriddal kezelünk, hogy a fürdő K"^ koncentrációja 2 percig 80 mMK legyen, majd friss oldattal mossuk. A K+-ionokkal való „kihívások“ közötti 16 perces szünetet a kísérlet alatt megtartjuk. A K+ „kihívásra“ való reagálások stabilizálódása után a teszt-vegyületet (potenciális kalcium-bemenet antagonista) a K+ kezelés előtt két perccel és a 2 perces kezelés alatt beadagoljuk a fürdőbe, majd a fürdőt tisztítjuk és friss oldattal mossuk. A teszt során a potenciális antagonistát logaritmikusán növekvő dózisokban adagoljuk (10-4 M értékig). A teszt-vegyületnek az izom tónikus kontrakcióját gátló hatását tekintjük a kalciumcsatorna-blokkoló aktivitás mértékének. IC50 értéknek azt a koncentrációt tekintjük, amelyben a teszt-vegyület az izom tónikus kontrakcióját 50%-kal gátolja. A kapott eredményeket a II. táblázatban foglaljuk össze. Calmodulin (CaM) — antagonista aktivitás (AtPase teszt) A Calmodulin (CaM)-antagonista aktivitást a CaM-aktivált Ca2+-Mg2+-AtPase-aktivitás gátlása alapján, az alábbi teszttel határozzuk meg. CaM-deficiens eritrocita-membránok készítése Eritrocita-membránokat patkányból Luthra és tsai módszerével készítünk [Biochim. Biophys. Acta 418:180 (1976)] Töltött eritrocitákat 0,172 mólos trisz-HCl pufferrel (pH=7,6) háromszor mosunk. A „buffy-coat“ frakciót óvatosan eltávolítjuk. Az ejitrociták hemolízisét oly módon indukáljuk, hogy 20 ml 50%-oseritroeita-szuszpenzióhoz (0,172 mólos trisz-HCl-pufferben, pH=7,6), 280 ml desztillált vizet adunk. Ezután 27,000 g mellett 30 percen át centrifugáljuk; pellet alakjában kapjuk az eritrocita-membránokat. A pelletet l millimól etilénglikol-bisz-(tó-amino-etil - -éter)-N,N,N’,N’-tetraecetsavat (EGTA) tartalmazó 20 millimólos trisz-HCl-pufferrel (pH=7,6) háromszor mossuk és a következő mosásnál az EGTA-t elhagyjuk. Csaknem fehér „kísértetek“ alakjában eritrocita-membránokat kapunk, amelyeket 18—18 millimólos hisztidin-imidazol-pufferrel (pH=7,l) egyszer mosunk, a kapott CaM-deficiens eritrocita-membrán-pelletet a fenti pufferban szuszpendálva kb. 2 mg/ml végső fehérje-koncentrációt nyerünk. Ca2+-Mg2+-AtPase assay Az AtPase assay lényegében a Gopinath és Vincenzi által leírtaknak felel meg [Bio-10 5 !0 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
