197596. lajstromszámú szabadalom • Mikrobiológiai eljárás antraciklin származékok és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
197596 5. példa Az 1. példa szerint járunk el, de az oltótenyészet tápközegének az összetétele az alábbi: glükóz 20,0 g szójaliszt I0,0g desztillált víz 1 liter pH 7,2 (28°C-on 72 órán át). 6. példa A kémiai inhibitor adagolása Aszkorbinsavból (vagy annak sójából) desztillált vízzel tömény oldatot (20 mg/ml) készítünk, és az oldatot sterilre szűrjük. A steril oldatot az 1—5. példákban már említett módon, a fermentálás kezdete után mintegy 24—32 órával adagoljuk a tenyészethez olyan mennyiségben, hogy 20—100 mg inhibitor/l végkoncentráció alakuljon ki. 7. példa Kémiai inhibitor adagolása Nátrium-azid tömény (20 mg/ml koncentrációjú) vizes steril oldatát adagoljuk a tenyészethez az 1—5. példákban már említett módon, azaz a fermentálás kezdete után 24— 32 órával, 10—80 mg/1 végkoncentráció eléréséig. 8. példa Kémiai inhibitor adagolása Vas (III)-kloridból vízzel 20 mg/ml koncentrációjú oldatot készítünk, és az oldatot sterilre szűrjük. Az oldatot az 1—6. példákban leírt tápközegekhez adjuk a fermentálás kezdete után mintegy 24—32 órával, 10—100 mg/1 végkoncentráció eléréséig. 9 9. példa A kezarirodinok elkülönítése Micélium és szürlet elválasztása érdekében mintegy 40 I tenyészlét centrifugálunk. A kezarirodin elkülönítését az I. szemléltető tábla mutatja. (a) A szűrt tenyészlé pH-értékét nátrium-hidrogén-karbonáttal 7,5-re állítjuk. A szűrletet 20 liter etil-acetáttal kétszer extraháljuk, és az egyesített extraktumokat vákuumban szárazra pároljuk. Mintegy 1,5 g maradékot kapunk, amelyet K-frakciónak nevezünk el. (b) Az elválasztott micéliumot háromszor 20—20 liter pufferoldattal (aceton és acetát-puffer 9:1 arányú elegyével) extraháljuk. Az egyesített extraktumokból vákuumban az acetont eltávolítjuk. A visszamaradó vizes fázis pH-értékét nátrium-hidrogén-karbonáttal 7,5-re állítjuk, majd a vizes oldatot háromszor 30—30 liter etil-acetáttal extraháljuk. Az egyesített extraktumokat vákuumban szárazra pároljuk. Mintegy 6,0 g maradékot (K-frakciót) kapunk. A kezarirodint tartalmazó K-frakciókat együttesen, de külön-külön is dolgozhatjuk 7 fel. Az A- és B-kezarirodin elkülönítését a II. szemléltető táblában mutatjuk be. (c) 7,5 g K-frakciót 4,5 X 40 cm méretű, Kieselgéllel töltött vékonyréteg-kromatográfiás oszlopra (H-BDH) adunk, majd kloroform, metanol, ecetsav, desztillált víz és trietanolamin 80:10:10:2:0,1 arányú elegyével eluáljuk. így mintegy 50 mg félig tiszta A-frakciót nyerünk, továbbá mintegy 60 mg félig tiszta B-frakciót; az egyik az A-kezarirodint, a másik a B-kezarirodint tartalmazza. A félig tiszta frakciókat először petroléterrel mossuk, majd külön-külön tovább tisztítjuk, mégpedig Kieselgélen végzett preparatív vékonyréteg-kromatográfiás módszerrel, oldószerként kloroform, metanol, ecetsav, desztillált víz és trietanolamin 80:10:10:2,0:0,1 arányú elegyét alkalmazva. 27 mg A-kezarirodint és 32 mg B-kezarirodint nyerünk. Az A- és B-kezarirodin jellemzése Az A- és B-kezarirodint mint tiszta anyagot kémiai elemzéssel és spektroszkópia módszerekkel azonosítjuk. Az ultraibolya abszorpciós maximum megméréséhez az anyagból 10—30 mg/1 koncentrációjú oldatot készítünk. Az adszorpciós színképet 200 nm és 800 nm közötti tartományban vettük fel. A magrezonanciás színképet HX-270 BRUKER Fourier Transform Magnetic Resonance típusú spektrométerben vettük fei 270 MHz frekvenciával. A minta koncentrációja 2,6—2,7 mg/0,5 ml 99,8%-os CDCI3 volt. A mintához 0,1 ml 5%-os nátrium-karbonát-oldatot (99,5%-os D,O-ban) adtunk. A tömegspektrumot MS-902S, AEI típusú tömegspektrométer segítségével, a FAB (Fast-Atom-Bombardment) pozitivion módszer szerint vettük fel. A-kezarirodin fizikai-kémiai tulajdonságai Küllem: narancs-piros por kémiai képlet: C4oH53OmN móltömeg: 771 UV-színkép: kmax (a) metanolban: 203,234,253,292,464, (sh) 478 (sh), 492, 512 (sh), 526, 575 nm. (b) 0,1 n HCl-metanol: 203, 234, 253, 292, 464 (sh), 478 (sh), 492, 512 (sh), 526 (sh), 558 (sh)nm (c) 0,1 n NaOH-metanol: 203, 239, 298, 554, 586 nm. !H-NMR-szinkép (CDC13 -j- 0,1 ml 5%-os Na2C03 DsO-ban) : 7,88 (d, J = 7 Hz, 1H), 7,69 (t, J = 8 Hz, 1H), 7,29 (d,J = 3Hz, 1H), 5,49 (d, J = 3 Hz, 1H), 5,21 (s, 1H), 5,03 (d, J = 3 Hz, 1H), 4,58 (s, IH),4,51 (q,J = 6Hz, 1H), 4,21 (q, J = 6 Hz, IH), 4,0—4,1 (komplex, 2H), 3,72 (s, 1H), 3,65 (s, IH), 3,56 (s, 1H), 3,25 (d, J = 20 Hz, IH), 2,56 (d, J = 20 Hz, IH), 2,34 (db, J = 14 Hz, IH), 2,15 (s, 8 5 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
