197595. lajstromszámú szabadalom • Eljárás expressziós vektorok előállítására
197595 tűk a DNS-t. A transzformáció után izolált p808—2 jelzésű plazmid csupán annyiban tér el a kiindulási plazmidtól, hogy hiányzik belőle a Stul hasítási hely és annak helyén a linker beépítésével egy EcoRI helyet képeztünk (6. ábra). 4. A továbbiakban E.coli lac operon első részét tartalmazó fragmentumot izoláltunk. A fragmentumot a pLBU3 plazmidból Hindi 11 és EcoRI restrikciós endonukleázokkal végzett hasítással nyertük [Gentz, R., Langer, A., Chang, A. C. Y., Cohen, S. N. and Bujard, H. (1981) Cloning and analysis of strong promoters is made possible by the downstream placement of a RNA termination signal. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78, 4936—40]. Az izolált fragmentum az EcoRI vég felől a HindlII hely felé haladva a következő részeket tartalmazza: 160 bp ismeretlen eredetű és funkciójú DNS, ami a lac promoter Pribnow-box előtt négy nukleotiddal kapcsolódik a lac operopból származó részhez. Ez utóbbi 240 bp a lac promoter egy része (—10-es régió), a teljes operátor, a mRNS iniciácíó helye, a riboszóma kötőhely az mRNS 5’ végének megfelelő részén, az ATG transzláció start szignál és a ß-galaktozidäz első hetven aminosavát kódoló rész. A fragmentumon kódolt N-terminális polipeptidnek (a-peptid) önmagában nincs ß-galaktoziddz aktivitása, bizonyos típusú, hibás ß-galaktozidäz molekulákkal — amelyek önmagukban szintén inaktívak — kölcsönhatva azonban képes részlegesen helyreállítani a funkcióképes enzimet (a-akceptor mutánsok). 5. A fent részletezett pLBU3 eredetű fragmentumot az EcoRI és HindlII enzimekkel hasított p808—2 plazmid DNS-sel összekapcsoltuk, és a ligátummal E.coli sejteket transzformáltunk. A transzformáit sejtekből az indikátort tartalmazó táptalaj felületén 24—36 óra alatt halványkék baktérium kolóniák nőttek ki, jelezve, hogy alacsony szintű a-peptid expresszió van. Ezekből plazmid DNS-t izoláltunk, és restrikciós enzimekkel végzett térképezéssel igazoltuk, hogy a p827—10 (MNG 00307) jelzésű plazmidot tartalmazzák (6. ábra), ami a két fragmentum megfelelő összeépülésével jött létre. 6. A következő fázisban deléciókat hoztunk létre az rrnB eredetű promoter és a transzlációs startpont között a transzlációs hatékonyság fokozása céljából. A p827—10 plazmidot EcoRI emésztéssel linearizáltuk, majd BAL31 nukleáz emésztéssel legfeljebb 400 bp-ig különböző hosszúságú szakaszokat távolítottunk el, és az így nyert plazmidokat ligázzal újra körré zártuk. Az így létrejött különböző szerkezetek közül azokat választottuk ki, amelyek indikátorlemezen intenzív a-peptid szintézist mutattak. A fenti módon keletkezett plazmidok egyikében, a PER—VI/23 jelű plazmidan az rrnB eredetű szekvencia a P2 promoter ún. —10-es régióját követően két nukleotiddal végződik, 7 és ehhez a lac eredetű transzkripciós transzlációs szabályozó régiók (lac operátor, riboszomakötőhely, transzlációs starthely) úgy kapcsolódnak, hogy távolságuk a P2 promotertől ugyanannyi nukleotid, mint eredetileg a lac operonban a lac promotertől volt. Ez a transzkripció szabólyozhatósága, valamint a transzláció szempontjából a lac operonhoz hasonlóan optimális feltételeket ' biztosít. Ugyanakkor a plazmid nem tartalmazza a P2 promoter —10-es régiójától downstream található, mintegy 25 nukleotid hosszúságú G —C gazdag régiót, melynek szerepét a promoterműködés szabályozásában kutatócsoportunk ismerte fel [Lukacsovich T., et al. J. Bact. 169, (1987) 272—277], és amely régió a sejt fiziológiás állapotától függően különböző mértékben gátolja a promoter működését. Az így keletkezett promoter konstrukció [s továbbiakban 6/23], esetében a transzkripciós iniciációs pont már a lac eredetű szekvenciában található és minden bizonnyal azonos a lac operon transzkripciós iniciációs nukleotidjaival (GGAATT). Más létrejött konstrukciókhoz képest, amelyekben az rrnB és a lac eredetű részek más pontokon kapcsolódnak, a pER—VI/23-as plazmid legalább egy nagyságrenddel nagyobb a-peptid expressziót biztosított (az a-peptid expresszió két komponensű rendszerben, ún. a-komplementáció révén, spektrofotometriásán jól mérhető; Miller: Experiments in molecular genetics, Cold Spring Harbor 1972). A pER-VI/23-as klón további előnye, hogy az rrnB és a lac eredetű szekvenciák összekapcsolódásának helyén egy egyedi Nsil restrikciós hasítóhely jön létre, amely a további átalakításokat jelentősen megkönnyíti. Ezek közül az átalakítások közül a legcélszerűbb az Nsil hely belső 4 nukleotidjának eltávolítása (A TGCA T); ami a restrikciós enzimmel történő emésztés utáni T4 DNS-polimeráz kezeléssel valósítható meg, amely a ragadós vég 4 túlnyúló nukleotidját leemészti. Ezután T4 ligázzal a plazmid molekulát újból összezárva olyan konstrukciót kapunk, amelyben a P2 promoter —10-es régiója érintetlen marad, azonban a transzkripciós iniciációs pont néhány nukleotiddal downstream tolódik. Teljes egészében nem tisztázott okoknál fogva a transzkripciós intenzitást ez az átalakítás tovább fokozza, anélkül, hogy a szabályozhatóság, vagy a transzlációs hatékonyság kimutathatóan változna. A továbbiakban a plazmid és a promoter jelölése pER-VI/23 [-Nsi], illetve 6/23 [-Nsi] lesz. A 7. ábra szemlélteti 6/23, illetve 6/23 [-Nsi] promoterek szekvenciáját. 7. A per-VI/23, illetve pER-VI/23 [-Nsi] plazmid az expressziós vektorokkal szemben támasztott legtöbb követelménynek megfelel. Lényeges hátrányuk azonban, hogy idegen gének befogadására csak korlátozott lehetőségeket nyújtanak. Ezt az a-peptid kó8 5 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
