197450. lajstromszámú szabadalom • Reagens és eljárás fagocita aktivitású sejtek kimutatására
2 197450 3 A találmány tárgya reagens és eljárás fagocita aktivitású sejtek kimutatására. A korszerű orvostudomány egyik fó törekvése, hogy a magzatok fejlődési rendellenességeit a terhesség minél korábbi szakaszában diagnosztizálják. Ismert, hogy a velócsózáródási rendellenesség sejtfestés útján diagnosztizálható, ugyanis velóc só záródási rendellenesség esetén a magzatvizben megjelenő fagocita aktivitású sejtek színreakcióval kimutathatók. Sejtfestő reagensként neutrálvörőst alkalmaznak [Orvosi Hetilap 125, 9 (1984); N. Eng. J. Med. 310, 1463 (1984)]. A • módszert rutinszerű klinikai diagnosztikai alkalmazása során azonban több nehézség merült fel. Megállapítottuk, hogy a reakció megbízhatóságát a neutrálvörös minősége nagymértékben befolyásolja, azaz különböző gyártóhelyektől származó neutrálvörőB festék felhasználásakor jelentős értékeltéréseket tapasztaltunk. Nehézségekbe ütközött a diagnosztikai célokra alkalmas neutrálvörös oldat elkészítése is. A neutrálvörös desztillált vizes oldata savas kémhatású (az 1 mg/ml koncentrációjú oldat pH-ja 3,1); a tiszta desztillált vizes oldat a sejteket a savas kémhatás, illetve a hipoozmotikus hatás miatt erőteljesen károsítja. A klinikai gyakorlatban rutinszerűen használt különböző vizes puffer- és tápoldatok egyike sem bizonyult megfelelő oldószernek, mert oldódás után csapadékkiválást tapasztaltunk. Szerves oldószerek használata sem vált be; így például etanolos neutrálvörös oldat alkalmazásakor nem kaptunk kellő szinhatást, a dimetil-szulfoxidos oldat esetén pedig a sterilszűréssel adódtak problémák. Célul tűztük ki olyan reagens oldat és diagnosztikai eljárás kidolgozását, amely a gyakorlatban nagy biztonsággal és egyszerűen alkalmazható fagocita aktivitású sejtek kimutatására. Kísérleteink során felismertük, hogy a neutrálvörös tartalmú citológiai reagens oldatnak megközelítőleg izoozmotikusnak kell lennie az esetlegesen kóros sejtekhez viszonyítva. Lényegesnek bizonyult az is, hogy a reagens oldat és a vizsgálandó minta (magzatvíz) elegye közel semleges kérahatású legyen. Meglepő módon azt tapasztaltuk továbbá, hogy a lizozira enzim jelenléte szignifikánsan elősegíti a sejtek festékfelvételét, ugyanakkor a festékoldat stabilitását is fokozza. Végül felismertük, hogy a reagens oldatnak a sejtek számára energiaforrásként hasznosíható szacharidot is kell tartalmaznia. Amennyiben hosszabb időn át tárolható reagens oldatra van szükség, célszerű a reagens oldathoz tartósítószert is adni. A találmány tehát fagocita aktivitású sejtek kimutatására alkalmas, neutrálvörőst tartalmazó reagens oldatra vonatkozik. A találmány szerinti reagens oldat vizes oldat formájában 0,2-0,8 tömeg* neutrálvörőst, 0,1--0,25 tömeg* lizozim enzimet, 0,8-2,0 tömeg* nátrium-kloridot, 0,1-0,3 tömeg* szacharidot és adott esetben 0,02-0,6 tömeg* tartósítószert tartalmaz; a vizes oldat pH-ja 3,0 és 8,0 közötti, célszerűen 3,5 és 5,0 közötti érték. A találmány tárgya továbbá eljárás fagocita aktivitású sejtek kimutatására neutrálvörössel végzett szinfestés útján. A találmány értelmében úgy járunk el, hogy 0,2- -0,8 tömeg* neutrálvörőst, 0,1-0,25 tömeg* lizozim enzimet, 0,8-2,0 tömegX nátrium-kloridot, 0,1-0,3 tömeg* glükózt és adott esetben 0,02-0,6 tömeg* tartósítószert vízben oldunk, az oldat pH-ját 3,0 és 8,0 közötti, célszerűen 3,5 és 5,0 közötti értékre állítjuk, az oldatot sterilre szűrjük, majd az Így kapott reagens oldat 1 térfogategységnyi mennyiségét 3-8 térfogategységnyi vizsgálandó mintával, célszerűen magzatvizzel keverjük össze, és a kapott sejtszuszpenziót önmagában ismert módon hemocitométerben megvizsgáljuk. A találmány szerinti reagens oldat szacharidként a sejtek számára energiaforrásként hasznosítható mono- vagy diszacharidokat, különösen előnyösen glükózt tartalmazhat. TartósitÓ8zerként - amennyiben erre szükség van - előnyösen benzoésavat és/vagy poli(vinil-alkohol)-t használunk. A sejtszuszpenzió hemocitometriás vizsgálatát az Orvosi Hetilap 125, 9 (1984) és N. Eng. J. Med. 310, 1463 (1984) közleményekben leírt módon végezzük. A hemocitometriás vizsgálat során a reagens oldattal kezelt sejtszuszpenziót inkubálás után centrifugáljuk, a felülúszót leöntjük, az üledéket mosó-hígitó oldattal keverjük össze, majd Bürker kamrában vizsgáljuk a színreakciót. Klinikai vizsgálatok céljára a találmány szerinti reagenst célszerűen reagens készlet formájában hozzuk forgalomba. A reagens készlet dózisegységekbe kiszerelt (célszerűen ampullákba töltött) reagens oldatból és dózisegységekbe kiszerelt (célszerűen ampullákba töltött) mosó-hígító oldatból áll, és a reagens oldat és a mosó-hígító oldat dózisegységeinek térfogataránya 1:(0,5—2). Mosó-hígító oldatként a citológiai vizsgálatokhoz erre a célra felhasznált, önmagukban ismert oldatokat alkalmazhatjuk. Különösen előnyösen használhatunk Hank-oldatot [Hank, J. H. és Wallace, R. E.: Proc. Soc. Exptl. Bioi. Med. 71, 196 (1949)]. Kiemelkedően előnyös olyan Hank-oldat használata, amelynek pH-ját N-hidroxi-etil-piperazin-N’-2-etánszulfonsavval 7,2 és 7,4 közötti értékre (előnyösen pH 7,3-ra) állítottuk be. Oltalmi igényünk a reagens készletekre is kiterjed. A találmány szerinti megoldás legfontosabb előnye, hogy a felhasznált oldatok stabilak, tartósítószer jelenlétében legalább 12 hónapig eltarthatok, és azonnal felhasználható formában kerülhetnek kiszerelésre. A találmány szerinti reagens oldat, illetve rea-3 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
