197358. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán tumorellenes anyag, valamint a fenti anyagot tartalmazó gyógyszerkészítmény előállítására
18 197358 19 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (i) lépésben az inkubálást közelítőleg 48 órán át 37 °C-on végezzük. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (ii) lépésben az elválasztást centrifugálással végezzük. 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy humán B-sejtként BE, BI, CL; CW, DE, DM, DS, EJ, EL, EQ, ER, FC, FD, FG, ARH-77, DAUDI, LukII, RPMI 1788, RPMI 8226, RPMI 8866 vagy ARA-10 sejtvonalat használunk. 6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (i) lépésben a sejteket forbol-12-mirisztát-134-acetát jelenlétében tenyésztjük. 7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a forbol-12-mirisztát-13- -acetátot 10 ng/ml koncentrációban használjuk. 8. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (i) lépésben közelítőleg 5xl05 sejt/ml kiindulási koncentrációt alkalmazunk. 9. Az 1. vagy 6. igénypontok szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (i) lépés szerinti inkubálás és az (ii) lépés szerinti elválasztás után a sejteket 2 nmól/1 etanol-amint tartalmazó szérum-mentes R-ITS PREMIX-ben szuszpendáljuk újra, majd ismét inkubéljuk, a sejtmentes felülúszót összegyűjtjük és koncentráljuk, a koncentrált felülúszót pufferoldattal ekvilibrált elválasztó oszlopra visszük, és az oszlopról kapott hTNF-aktiv frakciókat összegyűjtjük és koncent- 5 réljuk. 10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejteket 8-10xl05 sejt/ml koncentrációban szuszpendáljuk újra. 11. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal 10 jellemezve, hogy a sejtmentes felülúszó és a hTNF- aktív frakciók koncentrálását PM10 memb 'ánnal ellátott kevert Amicon cellában végezzük. 2. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal 15 jellemezve, hogy elválasztó oszlopként DEAE Sephi.dex A-50-nel töltött oszlopot használunk. 13. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 40x2,6 cm méretű DEAE 20 Sephadex A-50 oszlopot használunk. 14. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy pufferoldatként 0,15 mól/1 nátrium-kloridot tartalmazó 0,05 mól/1 koncentrációjú Tris-puffert (pH 7,3) használunk. 25 15. Eljárás gyógyászati készítmény elóállitá iára, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti eljárással előállított hTNF-et a gyógyszerkészitésben szokásosan használt hordozó- és/vagy egyéb segédanyagokkal 30 összekeverjük és gyógyászati készítménnyé formáljuk. Melléklet nélkül A kiadásért felel a Közgazdasági és Jogi Könyvkiadó igazgatója 90.2044.66-4 Alföldi Nyomda Debrecen - Felelős vezető: Benkő István vezérigazgató 11
