197358. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán tumorellenes anyag, valamint a fenti anyagot tartalmazó gyógyszerkészítmény előállítására
14 197358 15 tartó -78 °C-os vagy -20 °C-os raktározás után is megmarad. A PMA-val serkentett LuklI sejtek frakcionálatlan felülúszójában 100 egység/ml IFN-aktivitást találtunk. A DEAE-kromatogréfiás eljárással tisztított hTNF összegyűjtött frakcióiban nem találtunk interferon-aktivitást, sem a használt tisztított egér TNF-ben. A humán interferon aktivitást a hólyagos stomatis vírus WISH vagy GM 2767 sejtek elleni hatásának gátlásával mértük [Stewart W.E. II: The Interferon System, 1979 (Springer, Vienna)], és a rekombináns humán alfa-IFN (Hoffman-La Roche) esetén nemzetközi standarddal, humán természetes gamma-IFN esetén pedig laboratóriumi standarddal hasonlítottuk össze. A 2-4x10® egység/mg protein aktivitású rekombináns alfa-hIFN-t a Hoffman-La Roche-tól kaptuk, a leukocita eredetű természetes alfa-hIFN-t (aktivitása 0,64x10® egység/mg protein) a Kocher Laboratory (Bern, Svájc) állította elő, a Sloan-Kettering Institute értékelési programja keretében, az lxlO7 egység/mg protein specifikus aktivitású természetes béta-hIFN-t a Roswell Park Memorial Institute-tól (RPMI) kaptuk, mig az lxlO7 egység/mg protein specifikus aktivitású leukocita eredetű természetes gamma-hIFN dr. Berish Rubin-tói (Sloan-Kettering Institute) származott. Sem az egér, sem a humán TNF nem rendelkezett részlegesen tisztított állapotban kimutatható mértékű IFN-aktivitással. A különféle humán interferonok sem rendelkeztek kimutatható hTNF-aktivitással, mivel a fentebb ismertetett in vitro vizsgálatban nem mutattak citotoxikus vagy citosztatikus hatást érzékeny L-sejtekkel szemben. Mint a 3. táblázat adataiból látható, az előállított hTNF különböző sejtekkel szemben különböző hatást fejt ki. Citotoxikus hatásról akkor beszélünk, ha az élő sejtszám 7 nap múlva 35%-kal, vagy annál nagyobb mértékben csökken, míg citosztatikus hatás esetén a sejtszám csökkenése 7 nap múlva 35%, vagy annál nagyobb. Ebben a vizsgálatban - és a leírásban ismertetett többi vizsgálatban is - a fentebb leírt módon LuklI sejtekkel termelt hTNF-et használunk. Az adott példákkal azonban csak ismertetni kívánjuk a találmány szerinti megoldást, nem korlátozni. Más B-sejl vonalakból származó hTNF, vagy más humán sejtekből előállított TNF is használható in vivo és in vitro a különféle hűmen sejtekkel végzett vizsgálatokban. A 3. és 4. táblázatban közölt adatokból látható, hogy a hTNF az egér TNF-hez hasonló hatást fejt ki a humán emló-sejtvonalakrn, mivel mindkettő citotoxikus hatású a vizsgált emlőrák eredetű sejtvonalak többségére. A Lüdó és malanoma-sejtekre is hat a hTNF, a hatás azonban főleg citosztatikus. A vizsgált négy normál sejtvonal - tüdő-, vese-, magzati tüdő- és magzati bör-sejtvonal - közül egy sem volt érzékeny a hTNF-fel ízemben. Ennek alapján úgy 3. táblázat: hTNF hatása humán sejtvonalakra Citotoxikus hatás: SK-MG-4 (astrocitoma) MCF-7 (emlőrák) BT-20 (emlőrák) SK-BR-3 (nyakrák) SK-CO-1 (vastagbél-rák) RPMI 7931 (melanoma) Citosztatikus hatás: SK-LU-1 (tüdőrák) RPMI 4445 (melanoma) SK-MEL-29 (melanoma) SK-MEL-109 (melanoma) SK-OV-3 (petefészek-rák) Hatástalan: T-24 (hólyagrák) WI-38 (normál 5637 (hólyagrák) magzati tüdő) MDA-MB-361 (emlőrák) MY (normál vese-hám) S-48 (vastagbél-rák) F-136-35-56 SK-LC-4 (tüdőrák) (normál magzati tüdő) SK-LC-6 (tüdőrák) F-136-35-56 SK-LC-12 (tüdőrák) (normál magzati bőr) SK-MEL-19 (melanoma) SK-UT-1 (méhrák) SAOS-2 (öszlrogén szarkoma) IÎ20S (ösztrogén szarkoma) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 9
