197358. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán tumorellenes anyag, valamint a fenti anyagot tartalmazó gyógyszerkészítmény előállítására
2 197358 3 A találmány tárgya eljárás tisztított humán tumorellenes anyag (továbbiakban hTNF), valamint a fenti anyagot tartalmazó, humán tumorok kezelésére alkalmas gyógyszerkészítmények előállítására. Több, mint egy évszázada fedezték fel, hogy bizonyos bakteriális fertőzések során a fertőzött emberben jelenlévő tumorok egyidejűleg visszafejlődnek in vivő. Ezzel a felfedezéssel kezdődött a tumor nekrózis faktornak (TNF) nevezett tumorellenes anyag kutatása. Coley és mások is több, mint 40 éven át kezelték a humán rosszindulatú daganatokat bakteriális eredetű sejtmentes szűrletekkel vagy vegyes bakteriális vakcinákkal, gyakran pozitív eredménnyel. Tengerimalacokkal és egerekkel is végeztek kísérleteket. A tumorellenes hatás a fenti kísérleti állatokban súlyos vérzéses reakciókban nyilvánul meg a tumor magjában, a bakteriális kezelést követő 4 órán belül. Ezt kővetően lassabb, nekrotizáló hatás figyelhető meg, amelynek intenzitása a következő 48 óra alatt növekszik. A tumor színe egyre erősebben sötétedik, ami elhalásra és vérzésre utal, és sok esetben a tumor teljes visszafejlődését eredményezi. A fenti meglepő vérzéses elhalást - amely bizonyos kísérletes tumorok esetén Gram-negativ baktériumokkal vagy azok sejtfalából származó lipopoliszacharid természetű endotoxinokkal idézhető elő - már régóta a fentebb említett klinikai megfigyelések kísérleti megfelelőjének tekintik. A Sloan-Kettering Intézetben végzett kutatások azonban arra utalnak, hogy a bakteriális stimulálás hatására egy - feltehetően makrofág eredetű - anyag válik szabaddá, amely közvetlenül vagy közvetve maga felelős a tumorölő hatásért. Bizonyíték erre az a kísérlet, amelyben kimutatták, hogy a BCG-vel fertőzött, endotoxinnal injektált egerek széruma vérzéses nekrózist okoz transzplantált Meth A szarkoma sejteken és más tumorokon. Ugyanakkor a BCG-vel fertőzött egerek, vagy az endotoxinnal kezelt fertőzetlen egerek széruma hatástalan. Az endotoxin önmagában a legtöbb tumorsejtre nézve nem toxikus, in vitro kísérletekben. A hatásos szérum-komponenst nevezik tumor nekrózis faktornak (továbbiakban TNF-nek). A TNF aktivitást nem lehet a maradék endotoxinnak tulajdonítani, amelyet az endotoxin-maradék meghatározása alkalmas pirogén hatás, Limulus teszt és kémiai analízis segítségével mértünk. A TNF - eltérően az endotoxintól - in vitro közvetlenül toxikus bizonyos tumorsejtekre; a normális eredetű, tenyésztett sejtek nem károsodnak [Lloyd J. Old; New Developments in Cancer Therapy, MSKCC Clinical Bulletin; 6, 118 (1976); E. A. Carswell és munkatársai: Proc. Nat. Acad. Sei. USA 72, 3666-70 (1975)]. Egyéb rágcsálók - például patkányok és nyulak - is termelnek TNF-et, BCG- és endotoxin kezelés hatására. A TNF-et először elsődlegesen BCG-vel (Bacillus Calmette-Guérin) indukált, majd 2-3 hét múlva E. coliból származó endotoxinnal provokált egerek szérumában találták meg. Önmagában sem a BCG, vagy annak alább ismertetett megfelelői, sem az endotoxin hatására nem jelenik meg TNF az egérszérumban, mind a kettőnek jelenlétére szükség van. A BCG helyett a retikuloendoteliális rendszerben a BCG-hez hasonlóan erős makrofág vagy egyéb celluláris elem szaporodást kiváltó Corynebacterium granulosummal, Corynebaeterium parvummal, maláriával vagy Zymose.n-nal (élesztő sejtfal) is indukálhatjuk a TNF felszabadulást egérben. Ezek a BCG megfelelői. A BCG és endotoxin kezelés utáni szérűn: a szokásostól eltérő annyiban, hogy nem alvad meg teljesen. Egérben a TNF optimális termelését és annak vizsgálatát az alábbiak szerint végezzük: a) BOG: 2xl07 élő BCG-sejtet tartalmazó irokulummal érjük el a rétikuloendoteliális rendszer (RÉS) maximális stimulálásí'it és a szövetszaporodást b) endotoxin: 14-21 nap múlva, mikor a BCG-vel kiváltott RES-stimulálás a legnagyobb, 0,25-25 Mg endotoxint (E. coliból származó lipopoliszacharidot adunk az egereknek, a legnagyobb TNF-szint a legnagyobb dózissal érhető el c) T1F kinyerése: az optimális időpont 2 órával az endotoxin kezelés után van (későbbi időpontok kevésbé jók a sokk által kiváltott, keringési elégtelenség mial t) d) T1F vizsgálata: 1 In vivo A TNF-pozitív egérszérum nekrotizáló hatását (BALB/cxC57 BL/6)Fi hibridbé transzplantált BALB/c Meth A ascites sarcomén vizsgáljuk a következők szerint. Hét nappal a tumor szubkután transzplantálása után "n vivo megvizsgáljuk a TNF-pozitiv szérűn hatását a transzplantátumra, a hatást vizuálisan értékeljük 24 órán át. Reakció először 3-4 óra elteltével észlelhető. 7 napos transzplantátumban a nekrotikus válaszreakció általában a beadott 0,1-0,5 ml TNF-pozitív szérűn térfogatának felel meg. A +++ erősségű reakció azt jelenti, hogy a tumor teljesen, vagy majdnem teljesen elpusztult, és a látszólag élő tumoros szövetből csak egy gyűrű marad vissza. A 6 napos transzplantátumok kevésbé érzékenyek, az 5 naposok egyáltalán nem reagálnak. 2) In vitro A TNF-érzékeny L-M sejteket az American Type Culture Collection-tól származó klónozott egér L929 sejtekből nyertük. Az L-sejtek TNF-rezisztens sejtvonalát úgy állítottuk elő, hogy a TNF-érzékeny L-sejteket többször átoltottuk TNF-et tartalmazó táptalajba. A TNF a TNF-érzékeny L-sejtekre [L(S}] citotoxikus hatást fejt ki, míg a TNF-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
