197357. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kicsapott heterológ fehérjék tisztítására és reaktiválására
19 197357 20 oldásának és az aktivitás visszanyerésének módszerét. D. A fénytöréssel rendelkező testek képződésének növelése A találmány értelmében növelhetjük a gazdasejtben termelt, fénytöréssel rendelkező alakban oldhatatlanná tett fehérje mennyiségét a tisztítása előtt. Számos fehérje esetében, amikor termelésük a példákban részletezett módon történik, szükségtelen a mennyiségük növelése, mivel a kívánt fehérjének gyakorlatilag a teljes mennyisége ezeknek a fénytöréssel rendelkező testeknek az alakjában jelenik meg. Példaként ezekre a fehérjékre megemlitjük az állati növekedési hormonokat és a fibroblaszt interferont. Az emberi növekedési hormon esetén azonban az Escherichia coli által termelt fehérjének mindössze körülbelül 50%-a jelenik meg fénytöréssel rendelkező testek formájában, és a termelés csökken, ha nem a találmány szerint járunk el. Hasonló módon, az immun interferon jelentős része képződik fénytöréssel nem rendelkező anyag alakjában, és ha a fénytöréssel rendelkező testek elkülönítésére kidolgozott találmány szerinti eljárást kívánjuk alkalmazni, növelnünk kell ezeknek a testeknek a mennyiségét. Ennnél az eljárásnál azt használjuk fel, hogy kívánatos egy .elpusztító’ lépés beiktatása, amivel egyébként eleget tehetünk a rekombinált sejtek tenyésztésével és összegyűjtésével kapcsolatos törvényes biztonsági rendszabályoknak. Több elpusztitó módszer is rendelkezésre áll, és ezeket egyszerűen biztonsági okokból alkalmazzák, a fenti esetekben azonban az alkalmazásukkal a fénytöréssel rendelkező fehérje mennyiségének a növelése is elérhető. A találmány szerinti eljárás e változatánál a gazdasejteket vagy a tenyészetésükhöz használt táptalajon pusztíthatjuk el, vagy egy olyan szuszpenzióban, amelyet úgy kapunk, hogy a sejteket tartalmazó eredeti táptalajt centrifugáljuk vagy más módon koncentráljuk, a sejtpépet kinyerjük és vizes oldatban újból szuszpendáljuk. Az elpusztítás történhet hig savval vagy hőkezeléssel, különösen előnyösen pedig kis menynyiségben alkalmazott apoláros szerves oldószerekkel. Különösen előnyösen úgy járunk el, hogy a táptalajhoz 0,25% fenolt és 0,25% toluolt adunk, majd szobahőmérséklet és 45 °C közötti hőfokon, előnyösen 37 °C körüli hőmérsékleten inkubáljuk 15 perc és néhány óra közötti ideig, különösen előnyösen 0,5 óráig. Ha rendelkezésre áll megfelelő felszerelés, úgy is eljárhatunk, hogy a sejteket zárt térben összegyűjtjük, majd például 0,01-2 M ionerösségü, előnyösen 0,1-0,2 M ionerősségű, 5-9 közötti, előnyösen 6-8 közötti pH-értékű pufferoldatban szuszpendáljuk. A szuszpenzióhoz ezután kis mennyiségű szerves oldószert, például 0,25% fenolt és 0,25% toluolt adunk. További lehetőség, hogy a sejteket tartalmazó táptalajt vagy a sejtszuszpenziót 15-45 percig 60-80 °C-on tartjuk a sejtek elpusztítása céljából, vagy 0,5-1,5 közötti pH-értéket állítunk be. Ezeknél a műveleteknél a termelt heterológ fehérje jelentős mértékű további kiválása következik be, ha már addig nem volt kicsapva. A 9. példában egy olyan esetet ismertetünk, amikor ez az eljárás előnyös. A találmány szerinti eljárásnak ezt a változatát további találmány szerinti módszerekkel kapcsolhatjuk össze aktiv heterológ fehérje kinyerése érdekében. E. A heterológ fehérje oldása erősen denaturáló oldatban Szintén a találmány tárgyát képezi egy olyan eljárás, amelynek értelmében erős denaturáló oldat alkalmazásával oldjuk a fénytöréssel rendelkező fehérjéket az oldhatatlan vagy szemcsévé alakított formájukból. Jóllehet a fénytöréssel rendelkező testek formájában lévő fehérjék általában oldhatatlanok a citoplazmában fennálló körülmények között (és így a viszonylag kis ionerösségü pufferoldatokban is), oldhatóknak látszanak egyes denaturálószerek eléggé nagy koncentrációjú, általában 4-9 M koncentrációjú oldataiban. Különösen előnyös denaturálószerek a guanidinsók, jóllehet eredményesen alkalmaztunk detergenseket, például Tritont és nátrium-dodecil-szulfátot, továbbá tiocianátsókat is. 4-9 M közötti koncentráció használható a guanidinsók vagy a nátríum-tiocianát esetén, s különösen előnyös a 6-8 M közötti tartomány. A mosószereket 0,1-2%-os oldatban használjuk. Az oldat pH-jának összeférhetőnek kell lennie az illető fehérje jellemzőivel, úgy, hogy irreverzibilis denaturálás vagy fehérjehidrolízis ne lépjen fel. A denaturálószer optimális koncentrációja függ a szolubilizálni kívánt fehérjétől és az alkalmazott pH-értéktól. Amíg az oldhatóság - ha egyszer elértük - gyakran akkor is fennmarad, ha a szolubilizált heterológ fehérjét gyengébben denaturáló közegbe visszük át, nem célszerű a szolubilizálást ugyanezzel a gyengén denaturáló közeggel elkezdeni. Akár termodinamikai, akár kinetikai okokból a fehérje nem oldódik elfogadható időn belül ilyen kevésbé drasztikus körülmények között. Az oldathoz további komponenseket is adhatunk, hogy fenntartsuk a kívánt pH-értéket, és egyes esetekben más segédanya5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 11
