197357. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kicsapott heterológ fehérjék tisztítására és reaktiválására
53 197357 54 Szark fehérje konformációjának kialakítása Eredetileg szarkoma daganatokból elkülönített) .szark' elnevezésű fehérjét termeltünk oly módoni hogy az 1. példában leírtak szerint jártunk el transzformált sejtekből kiindulva, amelyeket McGrath, J. P. és Levinson, A.D. eljárásával állítottuk elő [Nature, 295, 423 (1982)]. A természetes puffer körülmények között oldhatatlan fehérje 3 mg mennyiségben 3 ml 7 M guanidin-oldatot, 300 (J 1 M trisz(hidroxi-metil)-amino-metán-oldatot (pH=8), 20 /ul 0,5 M etilén-diamin-tetraecetsav-oldatot, továbbá 400 /ul olyan oldatot adtunk, amely 200 mg/ml nátrium-szulfitot és 100 mg/ml nátrium-tetrationátot tartalmazott. Az oldatot szobahőmérsékleten egy éjszakán át állni hagytuk. Ilyen módon zavaros szuszpenzió képződött. A szuszpenziót 5 mM trisz(hidroxi-metil)-amino-metánt tartalmazó, pH=8 értékű 7 M karbamid-oldattal szemben dializáltuk. A kapott oldathoz hozzáadtunk 300 /ul 0,1 M glicin-oldatot (pH=9,5) és 90 /ul 10 mM béta-merkapto-etanol-oldatot, majd egy éjszakán át állni hagytuk, és 50 mM trisz(hidroxi-metil)-amino-metán-oldattal (pH=8,5) szemben dializáltuk. A kapott fehérje oldható volt, és egérbe fecskendezve olyan antitesteket indukált, amelyek kicsaphatok voltak autentikus szark fehérjével. 15. példa 16. példa Oldás guanid in-oldatban és exrakció karbamid-oldattal A 8. példában leirt Escherichia coli K-12 W3110/pFMB [A24] törzset az 1. példa A. pontjában leírtak szerint tenyésztettük, majd a sejteket centrifugálással összegyűjtöttük. A 281 g nedves súlyú sejtpépet tízszeres térfogatú foszfát pufferben szuszpendáltuk (összetétel: 50 mM nátrium-dihidrogénfoszfát, 5 mM etilén-diamin-tetraecetsav, 0,5 M nátrium-klorid, 0,1% béta-merkapto-etanol, pH= =7,0). (Ezt a foszfát puffert a továbbiakban PEB oldatnak nevezzük.) A kapott szuszpenziót kétszer átvezettük előhűtött Manton Gaulin présen 4137 kPa nyomáson és 1 liter/perc sebességgel. A szuszpenziót fél órán át centrifugáltuk 5000/perc fordulatszámon RC5B centrifugában, a szemcsét 10 percig szuszpendáltuk 10-szeres térfogatú PEB oldatban ultratorex alkalmazásával. A szuszpenziót 0,5 órán át centrifugáltuk 5000/perc fordulatszámon RC5B centrifugában, a kapott üledéket pedig felvettük 20-szoros térfogatú karbamid-trisz pufferoldatban (a továbbiakban UTB oldat), amelynek összetétele: 8 M koncentrációjú, frissen készített és ionmentesitett karbamid-oldat, amely 0,14 M trisz(hidroxi-metil)-amino-metánt, 0,1% béta-merkapto-etanolt tartalmaz, pH-értéke 8,3. Az oldatot 0,5 órán át tartottuk forrásban lévő vízfürdőn. Szobahőmérsékletre történő hűtés után 4-szeres téfogatú acetont adtunk hozzá, és az oldatot 1,5 órán át kevertük 6 °C körüli hőmérsékleten. A szuszpenziót 5000/perc fordulatszámon centrifugáltuk az RC3B centrifugában, és az üledéket felvettük 10-szeres térfogatú PEB oldatban. A szuszpenziót 0,5 órán át tartottuk forrásban lévő vízfürdőn, majd az RC5B készülékkel centrifugáltuk 5000/perc fordulatszámon, és a szemcsét 48 órán át szuszpendáltuk 2,2 literes 7 M guanidin-hidriklorid-oldatban, amely 0,1% béta-merkapto-etanolt is tartalmazott. A mintát ezután dializáltuk pH=8,0 értékű UTB oldat alkalmazásával, amelyet háromszor cseréltünk ki friss oldatra, majd kromatografálást végeztünk 5 cmx8 cm méretű DE-52 cellulóz oszlopon, amelyet előzetesen egyensúlyba hoztunk pH=8,0 értékű UTB oldattal. Az oszlopról távozó mosófolyadékot két frakcióban fogtuk fel, amelyek közül az egyik tiszta, a másik pedig zavaros frakció volt. A tiszta frakciót (>90% VP 3) 1,3 mg/ml körüli koncentrációig töményitettük be, és megvizsgáltuk a biológiai aktivitását. Összehasonlító kísérleteket is végeztünk, amelynél az antigént úgy állítottuk elő, hogy az Escherichia coli K-12 W3110/pFMB [A24] törzset ugyanúgy tenyésztettük, gyűjtöttük össze és kezeltük, mint fentebb, a szemcsét azonban a guanidin-hidriklorid-oldat helyett az UTB oldatban vettük fel. A vizsgálatnál a mintákat tengerimalacokba fecskendeztük be, és 28 nap múlva antiszérumot kaptunk. Az antiszérum antitest titerét annak alapján vizsgáltuk, hogy milyen mértékben képes megvédeni a szopós egereket a száj- és körömfájás vírusfertőzéstől. Az eredményeket az egerek 50%-ának immunitást adó antiszérumhigitás negatív logaritmusaként fejeztük ki (-log PDso). A fenti készítmény 100 /ug fehérjéjének befecskendezésével termelt antiszérum -log PDw értéke 3,2-3,4 volt, míg a kontroll kísérlettel előállított 100 /ug fehérje befecskendezésével kapott antiszérum -log PDso értéke kisebb volt, mint 0,3. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás biológiailag aktiv fehérje előállítására egy gazdasejt-kultúrában heterológ expresszió-termékként termelt fénytörő fehérjéből, azzal jellemezve, hogy a gazdasejtben termelt oldhatatlan fénytörő fehérjét - adott esetben a gazdasejt-kultúra sejtjeinek megölése és ezzel a fénytörő fehérje mennyiségének növelése, majd a sejtek elroncsolása után - elválasztjuk a nem-fénytőró terméktől, a fénytörő terméket egy ennek 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 28
