197357. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kicsapott heterológ fehérjék tisztítására és reaktiválására
39 197357 40 4. példa Sertés növekedési hormon (pGH) A sertés növekedési hormon génjét hordozó rekombinált DNS-t tartalmazó Escherichia coli K-12 W3110/pGH-exl törzset (amelyet a 439 977 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés és az annak megfelelő 83 306 730 számú európai szabadalmi leírás ír le, a bejelentés napja 1982. november 8.) fermentorban tenyésztettük, majd a sejteket összegyűjtöttük, amint azt az 1. példában ismertettük. (A fermentorban lévő sejteket az összegyűjtés előtt 0,25% fenollal és 0,25% toluollal kezeltük.) Az elkülönített, fénytöréssel rendelkező részecskék a nátrium- dodecil-szulfát jelenlétében végzett poliakrilamidgél-elektroforézis során egyetlen fehér jesávot adtak, amely 22 000 dalton molekulasúlyú standard anyagnak felel meg. A gél denzitométeres vizsgálat azt mutatta, hogy a gélen lévő teljes fehérmennyiség több mint 90%-a ez a sáv. Miután a részecskéket 7 M guanidin-oldatban oldottuk és dialízissel 7 M karbamid-oldatba átvittük, a sertés növekedési hormon jelenlétét radioaktív immunológiai vizsgálattal igazoltuk. 1 g nedves sejtpépből körülbelül 20 mg mennyiségben nyertük ki a fénytöréssel rendelkező részecskéket. Az 5A. ábra a pufferoldatban szuszpendált sejtpépben lévő, sertés növekedési hormont tartalmazó, fénytöréssel rendelkező részecskéket mutatja. Az 5B. ábrán ugyanez a sejtpép látható ultrahanggal végzett kezelés után. Az 5C. ábra az ultrahanggal kezelt sejtpép kis sebességű centrifugálásával nyert szemcsét mutatja be. 5. ábra Humán fibroblaszt interferon (FIF) A humán fibroblaszt interferon génjét hordozó rekombinált DNS-t tartalmazó Esherichia coli K-12 W3110/pFIF 347 törzset (amelyet Shepard, M. és munkatársai írtak le a DNA, 1, 125 (1982) szakcikkben] fermentorban tenyésztettük, majd a sejteket összegyűjtöttük és a fénytöréssel rendelkező részecskéket elkülönítettük az 1. példában leírtak szerint. A kapott fénytöréssel rendelkező részecskék 2-merkapto-etanol és nátrium-dodecil-szulfát jelenlétében végzett poliakrilamídgél-elektroforézise egyetlen fő sávot mutatott, amely 17 000 dalton molekulasúlynak felelt meg, és amely a fénytöréssel rendelkező részecskékben jelenlévő összes fehérjének 50%-át képviselte. A .Western biot' vizsgálat azt mutatta, hogy a fénytöréssel rendelkező fehérje specifikus módon reagált a tiszta humán fibrobal8zt interferon antitestjeivel. 1 g nedves sejtpépből 10-20 mg mennyiségben nyertük ki a fénytöréssel rendelkező részecskéket. Humán immun interferon (IIF) A humán immun interferon génjét hordozó rekombinált DNS-t tartalmazó Escherichia coli K-12 W3110/pIFN-gamma trp48 törzset (amelyet a 312 489 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés, a 77 670 sz. európai szabadalmi leírás és 2 107 718 sz. angol szabadalmi leírás ír le, a bejelentés napja 1981. október 19.) fermentorban tenyésztettük, majd a sejteket összegyűjtöttük, és a fénytöréssel rendelkező részecskéket elkülönítettük az 1. példában ismertetett módon. A kapott fénytöréssel rendelkező részecskék 2-raerkapto-etanol és nátrium-dodecil-szulfát jelenlétében végzett poliakrilamidgél-elektroforézise 17 000 dalton molekulatömegnek megfelelő fő sávot mutatott, amely a fénytöréssel rendelkező részecskék teljes fehérjetartalmának 50%-át képviselte. A .nyugati folt" vizsgálat azt mutatta, hogy a fénytöréssel rendelkező fehérje specifikus módon reagált a tiszta humán immun interferon antitestjeivel. 1 g nedves sejtpépből 10-20 g mennyiségű fénytöréssel rendelkező részecskéket különítettünk el. 6. példa 7. példa A szövetek ben lévő plazminogén aktívától' (TPA) Az emberi szövetekben lévő plazminogén aktivátor génjét hordozó rekombinált DNS-t tartalmazó Escherichia coli K-12 3110 pEPAtrpl2 törzset (amelyet a 398 003 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés és az annak megfelelő 93 619 sz. európai szabadalmi leírás és 2 119 804 sz. angol szabadalmi leírás ír le, a bejelentés napja 1982. július 14.) fermentorban tenyésztettük, majd a sejteket összegyűjtöttük, és a fénytöréssel rendelkező részecskéket elkülönítettük a sejtpéptól az 1. példában ismertetett módon. A fénytöréssel rendelkező részecskékben jelenlévő fehérje 80-90%-a az emberi szövetekben lévő plazminogén aktivátornak bizonyult a 2-mei'kapto-etanol és nátrium-dodecil-szulfát jelenlétében végzett poliakrilamidgél-elektroforézis, denzitométeres vizsgálat és .Western biot' vizsgálat alapján. 1 g nedvves sejtpépből 10-20 g mennyiségű, fénytöréssel rendelkező részecskéket különítettünk el. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 21
